论文部分内容阅读
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引发的主要危害初生仔猪的一种急性传染病,临床以呕吐、腹泻、身体消瘦及脱水为主要临床特征。该病不论任何年龄、任何品系均可感染,出生后7日龄以内的仔猪最为易感,且死亡率高达100%。近几年,PED在全球的流行范围之大,危害之严重,给养猪业带来了巨大的损失。因此,对于该病的防治和诊断具有重要的现实意义。S蛋白作为PEDV病毒表面的结构蛋白,由S基因所编码,S1具有多个B细胞中和抗原表位,是动物机体产生中和抗体的主要抗原蛋白。本研究以本实验室PEDV分离株CHYJ130331基因序列设计一对特异性引物,从S基因上扩增出一段具有中和抗原表位的截短S1片段。将PCR扩增得到的1062 bp的基因片段纯化回收后,克隆到载体PMD-18-T上,通过测序分析,结果与毒株序列号CHYJ130331进行比对,核苷酸序列同源性为100%;然后再将克隆化截短S1基因亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,获得了原核表达质粒pGEX-4T-S;再将重组质粒转化到表达宿主菌E.coli BL21(DE3)中,加入诱导剂IPTG,表达目的蛋白。同时优化诱导表达条件,当加入终浓度为0.6 mmol/L的IPTG,37℃条件下,诱导时间4 h时,蛋白表达效果最佳。经SDS-PAGE鉴定,结果显示,S1截短蛋白的分子量为72 KD,与预期大小一致。利用GST标签试剂盒对目的蛋白进行纯化,获得纯度较高的重组蛋白。Western-blotting鉴定结果显示,纯化的S1截短蛋白可以与PEDV阳性血清发生特异性结合,说明该纯化蛋白反应原性较好。母乳中含有大量的sIgA,因此,本研究利用AKATA制备型液相色谱蛋白分析仪从乳汁中分离纯化得到sIgA。纯化的sIgA经鉴定后,免疫两只SPF新西兰大耳兔制备兔抗猪sIgA阳性血清,对该阳性血清进行HRP标记,获得兔抗猪sIgA的酶标二抗。利用纯化的S1截短蛋白作为抗原进行包被,通过对各反应条件的优化,最终确定了乳汁中sIgA的间接ELISA检测方法的最佳反应条件:抗原包被浓度为12.5μg/mL,经37℃作用1 h后,4℃包被过夜;用封闭液(含1%BSA的PBST)37℃封闭90 min;待检乳汁用含有100mg/mL胃蛋白酶的醋酸钠溶液做40倍稀释后于37℃反应1 h;酶标二抗(用封闭液做1:1000倍稀释)于37℃反应45 min;加入底物后避光显色10 min。阴、阳性乳汁的临界值为0.371。对该方法进行特异性和重复性试验,结果显示,建立的方法可用于检测乳汁中的PEDV抗体检测,且具有良好的特异性和重复性。运用此方法对采自广东地区的120份乳汁进行临床样品抗体检测,检出样品的阳性率为38.33%(46/120),与韩国安捷公司IgA抗体检测试剂盒进行对比,两者的符合率为80.0%。