论文部分内容阅读
研究目的:本研究使用APP/PS1双转基因阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）小鼠模型:1)探讨16周自主跑轮运动对9周龄和24周龄AD小鼠（模拟AD临床前期和AD早期）认知功能及神经病理标志蛋白的影响是否存在差异;2)应用肠道菌群16S rRNA高通量测序和超高效液相色谱-质谱联用方法探讨自主运动影响两组AD小鼠认知功能及神经病理表现的潜在机制,以期从分子角度为寻找AD早期防治策略提供实验依据。研究方法:将28只8周龄雄性APP/PS1小鼠,随机分为AD临床前期运动组（YTGEx）、AD临床前期对照组（YTGCon）、AD早期运动组（ATGEx）和AD早期对照组（ATGCon）,每组7只。分两批对小鼠进行自主跑轮运动干预,AD临床前期组9周龄开始,AD早期组24周龄开始,各持续16周。运动组和对照组小鼠分别饲养于有跑轮和无跑轮的独立通风笼内。干预结束后,进行葡萄糖耐受测试（GTT）和胰岛素耐受测试（ITT）;用Morris水迷宫行为学测试方法评估AD小鼠认知功能。2天后,处死动物取血用于代谢组学检测;钝性分离出海马和顶颞叶皮质用于蛋白和代谢组学检测;取盲肠内容物用于肠道菌群测序。病理学检测指标主要包括:Aβ生成和聚集关键蛋白（ADAM10、IDE、BACE1、cathepsin B）及Aβ斑块沉积;tau磷酸化及调节磷酸化关键分子（p-tau ser396、p-tau ser404、p-tau ser202、p-tau thr205、p-GSK3β ser9、PP2A、CDK5、p-AMPK）;神经炎症关键蛋白（GFAP、Ibα1）;突触可塑性关键蛋白（Synaptophysin、PSD95和BDNF）。肠道菌群16S rRNA PCR扩增及高通量测序后,对测序后的数据进行分析,并使用斯皮尔曼相关分析法分析特定菌群与AD神经病理标志物的相关性。超高效液相色谱-质谱联用对血清和皮质样本进行代谢组学检测,对数据进行多变量分析、确定差异代谢物,并应用斯皮尔曼相关分析法分析差异代谢物与AD神经病理标记物的相关性。研究结果:（1）自主跑轮运动显著增加AD临床前期和AD早期小鼠的摄食量和能量摄入（p＜0.05）,但未显著增加其体重。自主跑轮运动显著改善AD临床前期小鼠的糖耐量和胰岛素耐量（p＜0.05）,但运动后AD早期小鼠的糖耐量和胰岛素耐量无显著性改变。（2）自主跑轮运动显著改善AD临床前期小鼠的认知功能,具体包括缩短潜伏期、增加停留在目标象限的时间以及穿越平台的次数（p＜0.05）。但自主跑轮运动后,AD早期小鼠在水迷宫测试中未表现出显著性差异。（3）自主跑轮运动未能显著影响AD小鼠皮质和海马中Aβ老年斑块的形态学;仅显著上调AD临床前期小鼠海马中ADAM10蛋白表达（p＜0.05）,显著下调AD早期小鼠的ADAM10和BACE1蛋白表达（p＜0.05）。自主跑轮运动后AD临床前期小鼠皮质和海马中p-tau在ser396、ser404、ser202和thr205位点的表达显著下调（p＜0.05）,p-GSK3β ser9的表达显著上调（p＜0.05）;而AD早期小鼠磷酸化tau蛋白及其调节蛋白并未发生显著性变化。（4）自主跑轮运动显著下调AD临床前期小鼠皮质和海马中神经炎症相关蛋白GFAP和Ibα1的表达（p＜0.05）;而AD早期小鼠仅海马中GFAP表达显著降低（p＜0.05）,其余未发生显著性改变。自主跑轮运动显著上调AD临床前期小鼠海马中 Synaptophysin、皮质中 Synaptophysin 和 BDNF 的蛋白表达（p＜0.05）;AD早期小鼠仅皮质中Synaptophysin显著增加（p＜0.05）。（5）自主跑轮运动显著增加AD临床前期小鼠肠道菌群多样性（p＜0.05）,但未增加AD早期小鼠的菌群多样性。自主跑轮运动后AD临床前期小鼠肠道中另枝菌属（Alistipes）水平显著减少（p＜0.05）,颤杆菌属（Oscillibacter）显著增加（p＜0.05）,LEfSe分析筛选出差异类群有EU454870g、Oscillibacter、EU504554g、EU504066g、EF097061g、EU505046g和EF096172g。自主跑轮运动后,AD早期小鼠变形菌门（Proteobacteria）、软壁菌门（Tenericutes）、拟杆菌属（Bacteroides）和粪杆菌属（Faecalibacterium）水平显著减少（p＜0.05）,Allobaculum水平显著增加（p＜0.05）,LEfSe分析筛选出差异类群有S24 7、乳杆菌目（Lactobacillales）、链球菌科（Streptococcaceae）、链球菌属（Streptococcus）、乳球菌属（Lactococcus）、军团菌属（Legionella）、军团菌科（Legionellaceae）、肠球菌属（Enterococcus）、肠球菌科（Enterococcaceae）和双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae）。（6）自主跑轮运动干预后AD临床前期小鼠的差异菌群与海马的tau病理和神经炎症标志物GFAP和和Ibα1具有相关性（P＜0.05）,与皮质的tau病理、神经炎症标志物、及突出可塑性标志物Synaptophysin具有相关性（P＜0.05）。（7）自主跑轮运动后,不同疾病阶段AD小鼠各自的血清和皮质样品均存在显著代谢差异。AD临床前期小鼠血清中的重要差异代谢物有:苯乙酰甘氨酸（Phenylacetylglycine）、L-缬氨酸（L-Valine）、氨基葡萄糖（Glucosamine）、甲酰胺基苯甲酸（Formylanthranilic acid）和肉豆蔻酸（Myristic acid）（p＜0.05）;皮质中的重要差异代谢物有:磷酸二氢丙酮（Dihydroxyacetone phosphate）和血清素（Serotoni）（p＜0.05）。AD早期小鼠皮质中的重要差异代谢物有:甲基丙二酸（Methylmalonic acid）和 L-胱氨酸（L-Cystine）（p＜0.05）。AD 临床前期小鼠血清中多种必需和非必需氨基酸代谢途径、三羧酸循环及相关能量代谢通路、支链氨基酸和脂肪酸代谢途径均出现显著改变（p＜0.01）;皮质中糖酵解和酮体代谢途径、磷脂酰肌醇、色氨酸、嘌呤、嘧啶和萜类物质代谢通路改变（p＜0.01）;而AD早期小鼠血清的差异代谢通路仅有少数氨基酸代谢以及糖醛酸和果糖代谢途径改变（p＜0.01）;皮质中氨基酸代谢、辅酶Q和萜类代谢、嘌呤代谢和三羧酸循环通路发生改变（p＜0.01）。（8）自主跑轮运动后,AD临床前期小鼠血清中差异代谢物除芥酸外,均与p-tau ser396、404和星形胶质细胞激活呈负相关（P＜0.05）,与突触可塑性呈正相关（P＜0.05）。皮质中的差异代谢物与海马和皮质的病理标记物关系较为复杂,且皮质中差异代谢物二氢胸腺嘧啶（Dihydrothymine）与其行为学测试中停留在目标象限的时间呈正相关（R=0.627,P=0.039）,法尼焦磷酸（Famesyl pyrophosphate）与其行为学测试中穿越平台的次数呈负相关（R=-0.603,P=0.05）。研究结论:（1）自主跑轮运动改善AD临床前期小鼠的认知功能,但对AD早期小鼠的认知功能无显著影响。（2）自主跑轮运动对AD临床前期小鼠神经病理学的改善作用大于AD早期小鼠:显著改善AD临床前期小鼠tau蛋白病理学、神经炎症和突触可塑性;但AD早期小鼠tau蛋白病理学未出现显著性差异,仅部分神经炎症和突触可塑性得到了改善。（3）自主跑轮运动显著增加AD临床前期小鼠的菌群多样性,但未改变AD早期小鼠的菌群多样性。自主跑轮运动改善AD神经病理表现可能与改善AD小鼠肠道菌群结构和组成有关,其中Alistipes、Oscillibacter、EF097061g和EF096172g可能是关键类群。（4）自主跑轮运动对AD临床前期小鼠的代谢影响比AD早期小鼠更加显著:AD临床前期小鼠血清中氨基酸代谢和三羧酸循环途径改变;皮质中糖酵解和酮体代谢、磷脂酰肌醇和脂肪酸代谢改变。AD早期小鼠血清中仅有少数氨基酸和胆汁酸代谢途径改变;皮质中仅氨基酸、辅酶Q和嘌呤代谢发生改变。（5）AD临床前期小鼠大多血清差异代谢物与tau病理和星形胶质细胞激活呈负相关;皮质差异代谢物与病理学标志物的相关性较复杂,主要有法尼焦磷酸与tau磷酸化和神经炎症呈正相关,与认知呈负相关;二氢胸腺嘧啶与突触可塑性呈正相关,与认知呈正相关。