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目的:TRIM(Tripartite motif,TRIM)蛋白参与细胞的生长、凋亡、细胞内的信号转导、自噬和肿瘤等多种非常重要的生命进程。我们的前期实验显示,呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus,RSV)感染过程中,大部分TRIM蛋白表达明显升高,提示TRIM蛋白在其中也发挥着重要的作用。现有的研究显示具有RING结构域的TRIM蛋白大多具有泛素连接酶功能,但功能各异。当病毒入侵宿主细胞时,机体通过固有免疫应答首先对抗病毒入侵,其中,固有免疫应答的一个重要方面是合成和分泌Ⅰ型干扰素(TypeⅠinterferon,IFN-Ⅰ),以阻止病毒从感染细胞向临近未感染细胞扩散。病毒入侵细胞后,不同的病毒基因会被胞内不同受体感知并结合,其中,视黄酸诱导基因-Ⅰ样受体(Retinoic acid-inducible geneⅠ(RIG-Ⅰ)-like receptors,RLRs)如RIG-Ⅰ可探测细胞中的病毒基因组RNA并与之结合,而TRIM25是这条通路的关键蛋白,其通过催化RIG-Ⅰ,诱导IFN-Ⅰ和其他炎症因子的产生。有文献报道TRIM38可抑制IFN-Ⅰ的产生。RSV属于单链RNA病毒,是导致婴儿和儿童支气管炎和肺炎的主要原因。近年来,RSV不仅容易引起散发性感染,而且还可能爆发大规模感染,导致全世界呼吸道感染的流行。但RSV至今没有合适的疫苗问世,因此,全球对RSV致病机制的深入研究从未停止。在我们的前期实验中,用RSV感染人呼吸道上皮细胞后进行全基因表达谱测序,结果显示TRIM25及TRIM38的表达均明显升高。二者在RSV病毒复制中具体发挥了什么作用?已知,TRIM25具有K63泛素连接酶活性,而TRIM38具有K48泛素连接酶活性,在RSV感染宿主细胞后,已知二者均参与调节IFN-Ⅰ的产生,那么二者在诱导IFN-Ⅰ的产生上是否存在交互作用?TRIM38是否竞争抑制TRIM25对RIG-Ⅰ的结合?对于这些机理研究,目前还不甚明了。鉴于此,本课题拟选取RSV为病毒模型,就TRIM38与TRIM25对RSV感染肺上皮细胞诱导IFN-Ⅰ产生机制的影响进行研究,为临床治疗RSV的实施方案提供新思路。方法:1 RSV对TRIM25和干扰素信号通路的影响1.1优化感染复数,最终选取感染复数为MOI=1的RSV-mGFP感染A549细胞(以后的实验均选取感染复数为MOI=1),选取感染的0 h,24 h,48 h,72 h,分别观察RSV-mGFP绿色荧光的变化。1.2收取上述不同时间点的感染细胞,分别提取细胞总蛋白和总RNA,Western blot检测不同时间点的TRIM25、RIG-Ⅰ、MAVS、TRAF6、NF-κB和TRAF3的蛋白表达;RT-qPCR评估IFN-α和IFN-β的mRNA转录水平。1.3将构建的pCAGGS-HA-TRIM25的质粒转染到A549细胞中,免疫荧光检测TRIM25在A549细胞中的定位。1.4 RSV感染双荧光素酶报告基因质粒转染的A549细胞48 h后,收取细胞,按荧光素酶报告基因试剂盒说明书进行操作,检测IFN-β启动子的活性高低。2 TRIM25通过RIG-Ⅰ通路诱导IFN-Ⅰ的产生。2.1将质粒pCAGGS-HA-TRIM25转染A549细胞以过表达TRIM25,24 h后,RSV感染再作用该细胞24 h,提取总RNA,RT-qPCR检测TRIM25、IFN-α和IFN-β的mRNA转录水平。2.2将质粒pCAGGS-HA-TRIM25和双荧光素酶报告基因质粒共转染A549细胞,RSV感染48 h,按试剂盒说明书进行操作,判断IFN-β启动子的活性变化。2.3 SiRNA敲低TRIM25后,RSV感染A549细胞48 h,提取总RNA,RT-qPCR检测TRIM25敲低效果及IFN-α和IFN-β的mRNA转录水平;提取细胞总蛋白,Western blot检测TRIM25蛋白水平的敲低效果,及RIG-Ⅰ、MAVS、TRAF6、NF-κB的表达。2.4以合适浓度的IMD0354(IKKβ抑制剂)预处理A549细胞30 min,加RSV病毒作用0 h,12 h,24 h,分别提取总蛋白和总RNA,Western blot检测p-P65和P65的蛋白表达,RT-qPCR检测IFN-α和IFN-β的mRNA转录水平。3 TRIM38与TRIM25对RIG-Ⅰ途径诱导IFN-Ⅰ的影响3.1 RSV感染过表达TRIM25的A549细胞24 h后,Western blot检测TRIM38的蛋白表达。3.2用不同剂量的人源IFN-β处理A549细胞12 h收取总RNA,以相同剂量IFN-β处理A549细胞,提取不同时间点总RNA,RT-qPCR分别检测TRIM25和TRIM38的mRNA水平。3.3将Vero细胞(天然基因缺陷,不表达抗病毒干扰素)过表达TRIM25,再感染RSV24 h,Western blot检测TRIM38的蛋白表达。3.4 RSV感染siRNA敲低TRIM38的A549细胞48 h后,Western blot检测TRIM25和RIG-Ⅰ的表达。3.5构建了pCAGGS-HA-TRIM38的真核表达质粒,以不同浓度的pCAGGS-HA-TRIM38质粒转染A549细胞,RSV感染该细胞24 h后,提取总RNA,RT-qPCR检测TRIM38、IFN-α和IFN-β的mRNA水平,提取总蛋白,Western blot检测TRIM38、TRIM25和RIG-Ⅰ的蛋白表达。3.6将质粒pCAGGS-HA-TRIM25和浓度递增的质粒pCAGGS-HA-TRIM38共转染A549细胞24 h后,提取总RNA,RT-qPCR检测IFN-α和IFN-β的mRNA水平;提取总蛋白,Western blot检测TRIM25、TRIM38和RIG-Ⅰ的蛋白表达。3.7将质粒pCAGGS-HA-TRIM25和质粒pCAGGS-HA-TRIM38共转染A549细胞,同时设单独转染质粒pCAGGS-HA-TRIM25和空载为对照。用RIG-Ⅰ的单克隆抗体对各个处理样本的全细胞裂解液进行经典磁珠式免疫沉淀,Western blot检测TRIM25、TRIM38与RIG-Ⅰ蛋白,同时检测全细胞裂解液中上述蛋白表达情况。结果:1 RSV-mGFP感染A549细胞0 h,24 h,48 h,72 h后,细胞的绿色荧光逐渐增加2 A549细胞感染RSV后,感染组IFN-α、IFN-β、TRIM25、RIG-Ⅰ、MAVS、TRAF6及NF-κB的表达均显著高于未感染组;荧光素酶报告基因结果显示IFN-β启动子活性较Mock组亦显著升高(P=0.0203),TRAF3的表达水平与未感染组无显著差异。3 RSV感染过表达TRIM25的A549细胞,过表达组的TRIM38、IFN-α和IFN-β的表达水平显著高于Mock组;双荧光素酶报告基因的实验结果亦显示过表达组的IFN-β启动子活性显著高于Mock组(P=0.0145)。4 RSV感染敲低TRIM25的A549细胞,敲低组的IFN-α和IFN-β的mRNA水平、RIG-Ⅰ、MAVS、TRAF6和NF-κB的蛋白表达水平均低于Mock组。5 IKKβ抑制剂预处理A549细胞,RSV感染该细胞后,随着p-P65的表达被抑制,IFN-α和IFN-β的表达水平显著低于Mock组。6不同剂量人源的IFN-β处理A549细胞,或相同剂量IFN-β处理A549细胞不同时间,TRIM25和TRIM38的表达水平均明显升高,且有剂量依赖关系。7 RSV感染过表达TRIM25的Vero细胞,过表达TRIM25组和空载组的TRIM38的蛋白表达没有显著差异。8 RSV感染敲低TRIM38的A549细胞后,RIG-Ⅰ的蛋白表达水平明显高于Mock组。9 RSV感染不同浓度质粒pCAGGS-HA-TRIM38转染的A549细胞,TRIM38随着质粒浓度的增加表达量逐渐升高;与Mock组相比,过表达组的IFN-α和IFN-β的表达呈降低趋势(P<0.05);RIG-Ⅰ的蛋白表达亦呈减少趋势。10共转染pCAGGS-HA-TRIM25和不同浓度pCAGGS-HA-TRIM38的质粒到A549细胞后,共转染组的IFN-α和IFN-β的表达呈降低趋势(P<0.05);TRIM38及RIG-Ⅰ的蛋白表达均呈降低趋势。11 RIG-Ⅰ能同时与TRIM25、TRIM38相互作用,在TRIM38存在的情况下,RIG-Ⅰ结合的TRIM25减少。结论:1 RSV感染A549细胞诱导了TRIM25表达,后者可能主要通过RIG-Ⅰ激活NF-κB途径诱导IFN-Ⅰ的产生。2 TRIM25诱导IFN-Ⅰ的表达,后者反馈性诱导了TRIM25及TRIM38的表达。3 TRIM38与TRIM25共存时,TRIM38与TRIM25竞争结合RIG-Ⅰ,从而抑制IFN-Ⅰ的表达。