卤虫,又名丰年虫,是一种具有4亿年进化历史的甲壳类动物。卤虫主要生存于内陆盐湖、海滨盐田等高盐水域。卤虫在这样极端的环境中进化出了两种不同的生殖方式：卵胎生和卵生。在水温适宜,日照较长,水域盐度适中的季节里,卤虫以卵胎生方式繁殖,即胚胎直接发育成能够游动的无节幼体。当水温下降,日照变短,生存水域盐度升高时,卤虫以卵生方式繁殖,胚胎在母体内发育一定阶段后,以外面包有卵壳的休眠胚胎形式被排出母体外。在休眠胚胎细胞内,细胞周期处于静止状态。休眠胚胎只有经过低温刺激,才能转变成活化的休眠胚胎。当适宜的环境来临时,活化的休眠胚胎继续发育,细胞周期也重新开始。卤虫胚胎所具有的这种能够使细胞周期发生停滞和重新开始的特性,使得卤虫成为了研究细胞有丝分裂的良好模式动物。研究指出AMPK是生命能量调控的中心。AMPK-α亚基是催化亚基,因此α亚基对于AMPK激酶功能的发挥起着重要的作用。在大多数物种中,AMPK-α亚基有两个异构体,即AMPK-α1和-α2。研究表明,AMPK-α1和-α2除了调控生命的能量状态之外,两个亚基在不同的组织,生长发育的不同阶段发挥着各自特有的调控功能。然而,AMPK-α1和-α2对于细胞有丝分裂的调控仍然不清楚。首先,我们检测了卵胎生卤虫胚胎发育过程中AMPK-α和-α2及其磷酸化的表达特征。Western blotting结果表明,在胚胎整个发育过程中,AMPK-α1的表达及其磷酸化维持在一个较为恒定的水平上。然而,AMPK-α2蛋白只在胚胎发育早期和无节幼体阶段有极微量的表达。因此我们推测AMPK-α1可能参与调控了胚胎发育过程中的有丝分裂。AICAR (AMPK的激活剂)注射和BrdU参入实验指出,注射了AICAR的卤虫胚胎细胞内部检测不出BrdU阳性信号。这个结果表明高活性的AMPK能够抑制细胞周期的进行和细胞的有丝分裂。此外,我们检测了卤虫休眠胚胎重新发育过程中AMPK-α1和-α2及其磷酸化的表达情况。从休眠胚胎重新发育的4小时到8小时,AMPK-α1的表达水平下降。从重新发育的12小时到24小时,AMPK-α1的表达水平上升。AMPK-α2随着发育的进行表达量一直升高。AMPK-α的磷酸化水平在休眠胚胎重新发育的前12小时保持在一个较高的水平,而在孵化出的无节幼体阶段降低到了胚胎发育第4小时的三分之一。BrdU参入实验表明,在重新发育的12小时之前,卤虫细胞内没有有丝分裂的发生。从发育的12小时之后,卤虫细胞内有大量的有丝分裂发生。免疫沉淀实验表明,细胞未发生有丝分裂时AMPK保持高磷酸化状态,而在有丝分裂时AMPK磷酸化水平降低。这些结果再次表明,高活性的AMPK能够抑制细胞的有丝分裂。为了研究AMPK的上游激酶LKB1对AMPK调控卤虫胚胎发育过程中细胞有丝分裂的影响,我们克隆了卤虫LKB1基因。卤虫lkbl编码373个氨基酸,分子进化分析结果表明卤虫与水蚤LKB1的亲缘关系最近。荧光定量PCR显示,在卤虫胚胎发育期间,双线期和无节幼体阶段lkb1的表达量与双卵期、胚胎发育早期和胚胎发育晚期有显著性差异。在休眠胚胎重新发育阶段,重启发育的第4小时和第8小时lkb1的表达量与以后的发育阶段的表达量有显著性差异。利用siRNA干扰技术,我们分别在卵胎生和卵生生殖方式的卤虫体内注射siRNA分子,降低lkb1的表达量。对早期胚胎形态的观察结果表明,lkb1的降低没有影响胚胎的早期发育。我们继续对发育中的胚胎进行观察,发现卵胎生的卤虫能产下正常游动的无节幼体。然而,卵生卤虫却产下发育不良的假胚胎。这些结果表明,LKB1只特异性的调控卵生卤虫的胚胎发育。最后,我们检测了卵生卤虫胚胎发育早期的细胞有丝分裂和AMPK的磷酸化状况。Western Blotting结果表明,lkbl表达量的降低能够促进细胞的有丝分裂。同时,降低lkbl的表达量之后,AMPK-α1的磷酸化水平下降。这些结果指出,LKB1-AMPK-α1对卤虫胚胎发育过程中的有丝分裂起着调控作用。同时,TUNEL实验结果表明,卤虫假胚胎形成的原因是lkbl表达量的降低导致了发育早期的细胞发生了凋亡我们的实验结果表明,AMPK参与调控了卤虫胚胎发育过程中细胞的有丝分裂过程。高活性的AMPK抑制细胞的有丝分裂,而且这种调控作用是通过AMPK的上游激酶LKB1来实现的。