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纤维素作为农作物秸秆的主要成分是限制秸秆饲料化利用的关键因素,挖掘高效纤维素酶是提高秸秆利用率的有效方法。植食性动物胃肠道微生物是纤维素酶的重要筛选来源,目前的研究主要集中在反刍动物瘤胃微生物,对其它纤维素降解能力强的动物胃肠道微生物研究较少,而且通过传统的微生物体外培养方法无法获得不可培养微生物所产纤维素酶。因此,本研究避开传统的微生物培养方法,利用宏基因组测序技术研究三种植食性动物胃肠道内容物中纤维素降解相关的微生物群落组成、代谢功能及纤维素酶基因的分布差异,利用宏基因组Fosmid文库挖掘新型、高效的纤维素酶基因,并通过纤维素酶基因的序列分析、异源表达及对秸秆的降解效果研究,验证了利用Fosmid文库筛选新型、高效纤维素酶基因的可行性。获得的主要研究结果如下:1.通过场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）观察、X射线衍射仪（XRD）及傅立叶变换红外光谱仪（FTIR）分析发现被圆唇散白蚁和松瘤象蛀食后的木材中纤维素结构被破坏,说明圆唇散白蚁和松瘤象对纤维素生物质具有强降解作用。2.利用宏基因组测序技术比较了5只西藏山羊瘤胃、1,800只圆唇散白蚁后肠及24只松瘤象肠道微生物,结果表明西藏山羊瘤胃中的Prevotella sp.FD3004和Ruminococcus flavefaciens丰度显著高于圆唇散白蚁和松瘤象肠道中的菌种丰度（P<0.05）;圆唇散白蚁后肠中Treponema primitia,Treponema azotonutricium,Treponema endosymbiont of Eucomonympha sp.和Treponema brennaborense含量显著高于松瘤象肠道和西藏山羊瘤胃中对应微生物的含量（P<0.05）;松瘤象肠道中Lactococcus lactis,Dysgonomonas capnocytophagoides和Lactobacillus fabifermentans的含量显著高于其它两种植食性动物胃肠道中的相应菌种（P<0.05）。这些差异菌种多数都具有纤维素类物质降解功能。3.比较不同植食性动物胃肠道内容物的纤维素酶和半纤维素酶活性发现西藏山羊瘤胃中β-葡萄糖苷酶活性显著低于圆唇散白蚁和松瘤象肠道中的活性（P<0.05）,松瘤象肠道中内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和外切葡聚糖酶活力均高于其它两种植食性动物胃肠道中的纤维素酶活力（P<0.05）。4.将宏基因组直接测序预测的基因进行功能注释,比较西藏山羊瘤胃、圆唇散白蚁后肠及松瘤象肠道微生物在“碳水化合物代谢”分类下三级通路的丰度,在西藏山羊瘤胃中ko00520、ko00500和ko00052丰度显著高于其它两种植食性昆虫（P<0.05）,ko00620在圆唇散白蚁后肠中丰度最高（P<0.05）,ko00640在松瘤象肠道中丰度最高（P<0.05）。糖苷水解酶（GH）家族中GH5、GH45、GH124、GH3和GH10在西藏山羊瘤胃中的丰度显著高于其它两种植食性动物（P<0.05）,GH51和GH116在圆唇散白蚁后肠中的丰度最高（P<0.05）,GH8、GH9和GH1在松瘤象肠道中的丰度显著高于其它两种植食性动物（P<0.05）。此外,西藏山羊瘤胃中的EC3.2.1.40、3.2.1.21和3.2.1.80丰度显著高于另外两种植食性动物（P<0.05）。上述结果表明,可将这三种植食性动物胃肠道微生物作为纤维素酶基因的筛选来源。5.利用宏基因组测序技术无法获得新型纤维素酶基因序列,所以本试验构建了西藏山羊瘤胃（1,700个克隆子,覆盖率大约为68 Mb）、圆唇散白蚁后肠（1,900个克隆子,覆盖率大约为76 Mb）以及松瘤象肠道（2,112个克隆子,覆盖率大约为84.48 Mb）的宏基因组Fosmid文库。从西藏山羊瘤胃、圆唇散白蚁和松瘤象肠道宏基因组Fosmid文库中通过功能筛选的方法分别鉴定到阳性克隆子98、244和153个。通过比较不同功能水解圈的大小,最终以能同时产内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的克隆子R-A2、RE1和T-B4开展后续基因筛选试验。6.从构建的阳性Fosmid质粒R-A2、R-E1和T-B4的亚克隆文库中筛选到3个同时产内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的双功能基因,分别命名为A2-Y12-2,Rbs A及Y14。经序列比对发现,A2-Y12-2和Rbs A与NCBI数据库中的两个已知蛋白序列相似（>99%）,但与已报道纤维素酶的氨基酸序列均同源性较低。此外,Y14对应的氨基酸序列与NCBI数据库中的已知序列均同源性较低（相似性为53%）,表明其为新型的纤维素酶基因,且通过蛋白质三级结构预测到Y14催化活性位点为Ser385和Asn388。7.将上述筛选到的3个双功能基因A2-Y12-2,Rbs A及Y14分别通过无缝克隆连接至p ET-28a（+）载体上,并将其转至Escherichia coli（E.coli）BL21（DE3）中成功诱导表达。通过酶学特性分析发现新型基因Y14所表达的内切葡聚糖酶在最适反应条件（50℃,p H5.5）时,比活力可达11.79 U/mg,高于双功能酶A2-Y12-2（50℃,p H 5.5）和Rbs A（37℃,p H 5.5）在最适反应条件下所产酶的比活力;基因Y14所表达的β-葡萄糖苷酶在最适反应条件（37℃,p H 8.5）时,比活力为0.41 U/mg,高于双功能酶A2-Y12-2（50℃,p H 8.5）和Rbs A（50℃,p H 8.5）在最适反应条件下所产酶的比活力。8.小麦秸秆和稻草被双功能酶Rbs A、A2-Y12-2和Y14在50℃从第0 d降解至第7 d时,粗纤维含量均有所降低,这表明本研究中的3个双功能酶在50℃均具有热稳定性。截至第7 d,双功能酶Y14对稻草的降解效果最好,CF降解率为18.16%;A2-Y12-2对小麦秸秆的降解效果最好,CF降解率为17.53%。通过FE-SEM、XRD和FTIR分析结果也表明双功能纤维素酶对秸秆中的纤维素均有降解作用,其中双功能酶A2-Y12-2和Y14对稻草和小麦秸秆中纤维素的降解效果优于Rbs A。综上所述,西藏山羊瘤胃、圆唇散白蚁后肠及松瘤象肠道中的宏基因组可作为筛选纤维素酶基因的来源;从构建的不同植食性动物胃肠道宏基因组Fosmid文库中筛选的新型纤维素酶基因丰富了现有的纤维素酶基因资源库,为提高秸秆类农副产品的畜禽饲料化利用效率提供参考依据。