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新生和断奶仔猪腹泻(porcine post-weaning diarrhea,PWD)是全球范围内影响养猪业发展的最为普遍的胃肠道疾病,主要与菌毛F4、F5、F6、F18和F41等介导的猪源产肠毒素大肠杆菌(ETEC)在仔猪肠道内的黏附、定植和感染有关,该病原不仅能够引发仔猪黄痢、白痢、水肿病和断奶仔猪腹泻等多种疾病,还易混合和继发多种疾病感染,给养猪业造成巨大的经济损失。其中,F4ac+ ETEC是主要的致病菌之一,其感染引起断奶仔猪腹泻,甚至导致仔猪发病死亡。而CpxRA双组分系统被认为是一种全局调控系统,有研究表明细菌为了应对各种外部环境条件,利用CpxRA双组分系统快速感知各种外部信号的刺激,控制一些毒力因子的表达,为细菌在宿主体内的生存提供适应性的优势。虽然CpxRA双组分系统在细菌运动、菌毛黏附、生物被膜形成、抗生素耐药性等生物过程中有重要的调控作用,但是在F4ac+ETEC中相关的毒力调控仍不清楚。因此,本研究以 F4ac+ETEC 国内参考株 C83902(O8:H19:F4ac+LT+STa+STb+)为研究对象,分析CpxRA双组分系统在F4ac+ETEC中所发挥的毒力调控作用,进一步阐释ETEC的分子致病机理。首先,利用Red同源重组成功构建缺失株C83902ΔcpxA、C83902ΔcpxR、C83902ΔcpxRA。基于上述ΔcpxA、ΔcpxR、ΔcpxRA基因缺失株成功构建的基础上,将表达cpxA基因、cpxR基因、cpxRA基因的pBR322质粒分别通过化学转化导入上述相应缺失株中,构建回补株,命名为C83902ΔcpxA/pcpxA,C83902ΔcpxR/pcpxR和C83902 Δ cpxRA/pcpxRA。细菌生长试验结果表明,野生株WT、ΔcpxR、ΔcpxRA缺失株和相应的回补株OD600值均无明显差异,而相较于野生株,ΔcpxA缺失株的生长显示出有减缓的影响,且ΔcpxA/pΔcpxA回补株的生长回复到了野生株的水平。这一试验结果表明CpxRA双组分系统影响C83902的生长。运动性试验结果表明,相较于野生株和回补株,ΔcpxA,ΔcpxR,ΔcpxRA缺失菌株在半固体培养基上的运动能力都有下降,其中,ΔcpxA运动能力极显著下降(p<0.01),ΔcpxR、ΔcpxRA运动能力显著下降(p<0.05),这一结果表明CpxRA双组分系统影响C83902的运动能力;生物被膜试验显示相较于野生株和回补株,ΔcpxA缺失株生物被膜形成能力下降78.3%(p<0.01),ΔcpxR缺失株生物被膜形成量下降约30.8%(p<0.05),ΔcpxRA缺失株生物被膜形成量下降约35.1%(p<0.05),进一步证实完整的CpxRA双组分系统在生物被膜形成过程中的重要作用。通过体外仔猪小肠上皮细胞IPEC-J2细胞的黏附试验发现,cpxA缺失株、cpxR缺失株及双缺失株的黏附能力分别下降约55%(p<0.01)、27%(p<0.05)、20%(p<0.05),这些结果表明CpxRA双组分系统对C83902运动性,生物被膜的形成,黏附起正调控作用;随后通过Real-time PCR分别检测野生株,缺失株以及相应回补株中鞭毛主要亚单位fliC,Ⅰ型菌毛主要亚单位fimA,F4菌毛主要亚单位faeG转录量的变化,结果显示,相较野生株C83902,ΔcpxA缺失株中fliC,fimA,faeG基因的转录量分别下降了约73%、70%、83%,差异显著(p<0.01);ΔcpxR缺失株中fliC,fimA,faeG基因的转录量分别下降了约48%、40%、34%(p<0.05),ΔcpxRA缺失株中fliC,fimA,faeG基因的转录量分别下降了约32%、27%、42%(p<0.05)。上述结果表明,CpxRA双组分系统参与调控鞭毛、I型菌毛和F4菌毛的表达。同时,通过Real-time PCR还检测了 C83902存在的其他毒力因子的表达,结果显示缺失株中细菌Ⅱ型群体感应系统相关的luxS和pfs基因、热敏肠毒素eltB的表达量也显著下调,回补株中各基因转录水平均有部分回复,且与野生株基因转录水平无显著差异(p>0.05)。这表明完整的CpxRA双组分系统正调控C83902细菌Ⅱ型群体感应系统和热敏肠毒素的表达。此外,氨基糖苷类抗生素的耐药性试验发现,相较于野生株和回补株,cpxA基因的缺失能够显著增加C83902对于庆大霉素、卡那霉素、链霉素等氨基糖胺类抗生素的耐药性,而ΔcpxR、ΔcpxRA基因的缺失并不影响C83902对氨基糖苷类抗生素的耐药性。通过Real-time PCR检测cpxA缺失株、cpxR缺失株及双缺失株中响应调节因子cpxR转录水平,结果显示相对野生株和回补株,ΔcpxA缺失株中cpxR基因的转录量增加了约35%(p<0.05),进一步证实cpxR基因的过表达可能增加细菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性,但其潜在机制有待进一步探析。综上所述,CpxRA双组分系统对F4ac+ETEC毒力因子的表达有重要作用,同时也影响了细菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性,在细菌应对抗生素压力环境时发挥重要作用。本研究结果为进一步阐释F4ac+ETEC的分子致病机制奠定了基础,为后期研究细菌与耐药性相关机理奠定简要试验依据。