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糖鞘脂(Glycosphingolipid,GSL)是一类广泛分布在脊椎动物细胞和体液中,由头部糖链结构与尾部脂质神经酰胺连接组成的具有水脂双亲性的生物大分子。它是细胞黏附、细胞生长、细胞凋亡、细胞增殖、血管生成、炎症反应、维持细胞内稳态等诸多细胞活动的重要参与者,被认为是“细胞社会学”中重要的一类分子,因而单个细胞中的糖鞘脂组分是高度动态的,并与细胞的发育和细胞微环境密切相关。GSL的分析方法学是深入认识GSL生物学功能与研究GSL与疾病之间关系的基础。肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,在恶性肿瘤死亡顺位中占第2位。在我国,90%的肝癌是肝细胞癌(Human Hepatocellular carcinoma,HCC)。本论文首先使用本实验室已建立的凝集素芯片检测GSL糖链技术,分析了人正常肝细胞系(HL-7702)和具有低转移能力的HCC细胞系(MHCC97L)及具有高转移能力的HCC细胞系(MHCC97H和HCCLM3)中GSL糖链结构的表达谱,发现与对照组(HL-7702细胞)相比,有27种凝集素(例如ECA、GSL-I和DSA)所特异识别的糖链结构在HCC细胞GSL中的表达有显著差异。其中,有20种凝集素(例如MAL-II、DBA和AAL)所特异识别的糖链结构在具有低转移潜能的MHCC97L细胞GSL中发生了显著变化,包括14种识别的糖链结构发生了显著表达上调的凝集素(例如MAL-II、PTL-I和DBA,所有Ratio≥1.544,P≤0.05)和6种识别的糖链结构发生了显著表达下调的凝集素(例如WFA、AAL和LCA,所有Ratio≤0.632,P≤0.001);有17种凝集素(例如PNA、LCA和SBA)所特异识别的糖链结构在具有高转移潜能的MHCC97H细胞GSL中发生了显著变化,包括12种识别的糖链结构发生了显著表达上调的凝集素(例如PNA、ECA和LTL,所有所有Ratio≥1.550,P≤0.05)和5种识别的糖链结构发生了显著表达下调的凝集素(例如ECA、ACA和SBA,所有Ratio≤0.596,P≤0.01);有18种凝集素(例如EEL、HHL和PNA)所特异识别的糖链结构在具有高转移潜能的HCCLM3细胞GSL中发生了显著变化,包括11种识别的糖链结构发生了显著表达上调的凝集素(例如WFA、GNA和GSL-II,所有Ratio≥1.509,P≤0.01)和7种识别的糖链结构发生了显著表达下调的凝集素(例如DSA、ACA和RCA-120,所有Ratio≤0.604,P≤0.01)。总体来看,凝集素PNA(所有Ratio≥1.814,P≤0.01)识别的Galβ1-3Gal NAc,Glc NAcα1-3/1-4Gal,Gal NAcβ1-4Glc NAc糖链结构、LTL(所有Ratio≥2.414,P≤0.05)识别的Fucα1-2Gal,Fucα1-3Glc NAc糖链结构、GNA(所有Ratio≥1.578,P≤0.05)识别的Galα1-3Galβ1-4Glc NAc糖链结构、MAL-I(所有Ratio≥1.602,P≤0.01)识别的Galβ1-4Glc NAc糖链结构、和DBA(所有Ratio≥1.550,P≤0.05)识别的Gal NAc,Gal NAcα1-3(Fucα1-2)Gal糖链结构在HCC细胞GSL中均发生显著上调表达,凝集素ACA(所有Ratio≤0.603,P≤0.001)识别的Galβ1-3Gal NAc糖链结构和AAL(所有Ratio≤0.536,P≤0.01)识别的Fucα1-3Galβ1-4Glc NAc,Fucα1-6Glc NAc糖链结构在HCC细胞GSL中均发生显著下调表达。使用MALDI-TOF/TOF-MS技术进行肝癌细胞和人正常肝细胞GSL糖链的鉴定与分析。通过将已报道的针对大规模原材料(~200 g)的次氯酸钠氧化释放GSL糖链法进行改造并首次成功应用于小规模(~108个细胞)生物样本中,将得到的GSL糖链样本进行质谱鉴定与分析,结果显示:在HL-7702、MHCC97L、MHCC97H、和HCCLM3细胞GSL糖链中,各有11(例如m/z 876.298[Gal NAcβ1-4(Neu Acα2-3)Galβ1-4Glc]、m/z 893.314[Galβ1-3(Fucα1-4)Glc NAcβ1-3Galβ1-4Glcβ:CG]和m/z 1038.351[Galβ1-3Gal NAcβ1-4(Neu Acα2-3)Galβ1-4Glcβ:CG])、11(例如m/z1038.351[G alβ1-3Gal NAcβ1-4(Neu Acα2-3)Galβ1-4Glc]、m/z 1055.366[Fucα1-2Galβ1-3Gal NAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc]和m/z 1134.370[Galβ1-3Glc NAcβ1-3Galβ1-3Glc NAcβ1-3Galβ1-4Glc])、11(例如m/z 747.256[Galβ1-3Glc NAcβ1-3Galβ1-4Glc:CG]、m/z 893.314[G alβ1-3(Fucα1-4)Glc NAcβ1-3Galβ1-4Glcβ:CG]和m/z 1329.447[Neu Acα2-3Galβ1-3Gal NAcβ1-4(Neu Acα2-3)Galβ1-4Glcβ:CG])和15种(例如m/z 1112.388[Galβ1-3Glc NA cβ1-3Galβ1-3Glc NAcβ1-3Galβ1-4Glc]、m/z 1201.424[Galα1-3(Fucα1-2)Galβ1-4(Fucα1-3)Glc NAcβ1-3Galβ1-4Glc]和m/z 1242.451[Gal NAcα1-3(Fucα1-2)Galβ1-4(Fucα1-3)G lc NAcβ1-3Galβ1-4Glc])GSL糖链被鉴定及注释,与正常对照组相比,HCC细胞中G SL糖链的分布更为广泛,且复杂程度有所提升。结合凝集素芯片的GSL糖链分析结果,在HCC中发现了异常上调表达的核心糖链结构主要为Lacto-、Neo Lacto、和Gl obo-的岩藻糖基化的GSL以及唾液酸化的GSL。总体来看,Galβ1-3(Fucα1-4)Glc NA cβ1-3Galβ1-4Glc:Cer、Fucα1-2Galβ1-3Glc NAcβ1-3Galβ1-4Glc:Cer、Gal NAcα1-3(Fucα1-2)Galβ1-3Glc NAcβ1-3Galβ1-4Glc:Cer等结构在具有高转移潜能的HCC细胞系中呈现上调表达。本论文最后利用本实验室制备的糖基因芯片对HL-7702和HCC细胞内的糖基因进行转录水平分析,然后利用实时荧光定量PCR对筛选出的差异性表达的糖基因进行验证。发现:相比于对照组,在具有低转移能力的HCC细胞系MHCC97L和具有高转移能力的HCC细胞系MHCC97H和HCCLM3中均表达上调的糖基因有37个(例如CTSA、HYAL2和AHSG),均下调表达的糖基因有57个(例如AGA、B3GALT5和COX7C)。在糖基因芯片中共有256±24种探针显示了有效的结合信息,约占探针总数的63.68%。将筛选出在HCC细胞中有差异表达的糖基因以及GSL相关糖基因导入TCGA数据库在线分析,在公共数据库中进行大样本量的肝癌患者组织与健康对照间的GSL糖链合成与代谢相关基因的转录水平调查。进行不同转移能力HCC细胞GSL糖链合成与代谢通路的综合分析,并重点探讨在HCC发生发展过程中Globo-系列GSL的糖链合成通路的变化及其与HCC细胞转移能力的关联性。发现在HCC的发生发展过程中,鞘脂的合成通路在肝癌的发生发展过程中无明显变化,而Ganglio-系列的Siaα2-3连接唾液酸化GSL糖链的合成水平随HCC细胞转移潜能的增加而增加,Globo-系列GSL中,Fucα1-2连接的岩藻糖基化GSL的合成水平与HCC细胞转移潜能的增加而增加,且该系列中Siaα2-3连接唾液酸化GSL糖链的合成水平也随HCC细胞转移潜能的增加而增加,且该系列中唾液酸转移酶(ST3GAL2)的转录水平也随HCC细胞转移潜能的增加而增加。