研究背景近年来科学界提出“卫生假说”的概念,指出过分强调卫生,拒绝接触一切细菌可能是导致自身免疫性疾病或过敏性疾病的病因。拥有正常肠道菌群的健康宿主若能与菌群建立良好的共生关系,则可能预防上述疾病的发生,这说明肠道菌群不仅协助宿主消化食物及提供养分,还对宿主的健康产生深远的影响。人类肠道菌群分为9个门,其中以厚壁菌门(50-70%)和拟杆菌门(10-30%)为主要优势菌,两者相加可达肠道菌群总数的98%,其它次优势菌或含量较少的菌门包括放线菌门、变形杆菌门、梭杆菌门等。近年来发现许多疾病与肠道菌群紊乱有密不可分的关系,以肠道原籍菌研发而成的益生菌成为了这些疾病新的治疗方式。益生菌是一组宿主服用一定剂量后能够获得健康效益的活的微生物。至今研发最为成熟的益生菌为乳酸杆菌及双歧杆菌,分别来自厚壁菌门和放线菌门,拟杆菌门作为肠道菌群第二大优势菌门,却至今未有代表益生菌菌株面世,是为益生菌研发历史上的一道空白。近年来,拟杆菌门其中一员——脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis,B.fragilis)进入公众视野,有关其益生作用的科研论文陆续被发表,因此有人提出“B.fragilis是一株潜在的益生菌”。B.fragilis是严格厌氧的革兰阴性菌,主要定植在结肠,为人类肠道重要的共生菌,从方方面面影响着人类健康。B.fragilis菌体表面有一个结构特殊的多糖A(PSA),PSA是B.fragilis发挥免疫调节作用的关键因子。经研究证实,PSA能够保护三硝基苯磺酸(TNBS)或肝螺杆菌诱导的小鼠肠炎模型,促使宿主分泌大量抗炎因子IL-10从而减轻肠道炎症。PSA还通过抗炎作用防止小鼠中枢神经脱髓鞘,预防脑脊髓膜炎发生。此外,PSA能协助B.fragilis在小鼠体内竞争抑制汉式巴尔通体感染,减轻其致病能力。近期发现B.fragilis能修复自闭症小鼠的“肠漏”现象,改善行为问题,而该作用与PSA无关,说明除了 PSA,B.fra ilis还具有其它有益成分。炎症性肠病、自闭症、中枢脱髓鞘均为临床上难治疾病,开发切实有效的微生态制剂已经势在必行。B.fragilis对上述疾病的疗效已经得到确证,是极具潜力的益生菌候选者。本课题组从新生儿科发育良好的健康婴儿粪便中分离筛选获得一株新型B.fragilis,具有自主知识产权。考虑B.fragili 具备的优秀性能,我们力图将其开发为微生态活菌制剂。根据中国药典2015年版针对微生态活菌制品的定义,认为微生态活菌制品应为人体内正常菌群成员或者具有促进正常菌群生长和活性作用的无害外籍细菌,用于预防和治疗因菌群失调引起的相关症状及疾病。B.fragilis为人体内肠道原籍菌,其纠正免疫缺陷、治疗IBD、预防中枢脱髓鞘、改善自闭症等益生作用已经被国外研究证实,符合成为微生态活菌制剂的基本前提。参考国内外益生菌研发的研究进展,益生菌安全性评价的首要工作是菌株鉴定,因为确定菌株的“身份”有助于了解菌株相关生物学或是工业上的特性,方便正确描述,也便于追踪和监督益生菌在使用过程中可能出现的问题。其中鉴定的内容主要包括菌株的基因信息、形态特征、生长特性和生理生化特点。耐药性转移风险也是益生菌安全性评价工作中必须检验的一环,因为携带可转移的抗生素耐性基因可能会因为抗性转移导致肠道致病菌发生耐药,存在高风险,因此只有那些不含有可转移抗性基因的菌株方可认为是具有安全性的菌株。另外,安全性评价工作还包括益生菌对胃肠道极端环境的耐受能力、黏附肠上皮细胞能力、耐氧能力、对动物及细胞的毒性影响等。若要将本株新型B.fragilis开发成为微生态活菌制剂,首要任务是完成其安全性评价。因此,本课题将针对本株新型B.fragilis的安全性进行探索,为其开发为微生态活菌提供研究基础。研究目的1、基于16s DNA和全基因组测序构建系统发育树,确定菌株的种属关系,对比现有数据库查找其可能携带的毒力相关基因及耐药基因;2、了解该菌的形态学特点、培养特性、耐氧及黏附能力;3、分析该菌的生理生化特点及代谢产物主要成分;4、了解该菌的耐药情况;5、考察该菌在人工胃肠液、胆汁中的存活情况;6、鉴定该菌对动物及细胞是否具有安全性。材料与方法一、菌株基因鉴定:提取本株B.fragillis总DNA,经16s扩增、测序,通过Blast比对,找出近源菌株;经全基因组测序,构建系统发育树,与标准株进行同源性比对,确定菌株来源;通过序列比对注释可能携带的毒力相关基因和耐药基因。二、菌株形态学特点及基本特性:经过48小时37℃厌氧TSA血琼脂平板培养后,观察培养菌落特点、革兰染色形态、扫描电镜和透射电镜下细微结构是否符合《伯杰氏细菌鉴定手册》描述;菌株以1:100接种于新鲜培养基,经厌氧箱37℃厌氧培养24小时,每隔2小时检测OD600值;收集对数期菌并以新鲜培养基重悬,调整浓度为1×l09cfu/ml,于37℃孵箱(空气)中培养96小时,分别于0、4、8、16、24、36、48、72、96小时取0.5ml菌液倍比稀释计数;每孔肠上皮细胞(LoVo细胞)数目为(5～10)×104个,(5～10)×106CFU B.fragilis 以 MOI=100 感染细胞 30、60和90 min,检测黏附于细胞的细菌数目,计算黏附率。三、生理生化特点及代谢产物分析将菌液加入Biolog生化鉴定板中厌氧培养16-24小时,利用酶标仪读取数据,对照为ATCC株;向离心后菌体滴加入3%过氧化氢,检测过氧化氢酶是否阳性;将待检菌株穿刺接种于明胶培养基中,厌氧培养48小时后置4℃冰箱内3-4小时检测明胶液化实验;于含血固体培养基中培养,观察是否出现溶血环;接种菌体于半固体培养基,观察动力实验;收集对数晚期菌液,分析上清液中代谢产物。四、耐药实验针对全基因组测序结果比对筛选出本株菌可能携带的耐药基因,通过耐药实验验证,收集菌液并稀释至107cfu/ml,加入含抗生素的96孔板中,阳性对照组为菌液加生理盐水,阴性对照组为生理盐水,厌氧培养48小时后经酶联仪检测波长600nm的读数,判断本菌对各抗生素的最小抑菌浓度(MIC)。五、胃肠液、胆汁耐受实验配制pH2.0、pH3.0、pH4.0含有胃蛋白酶的胃液及pH6.8含有胰蛋白酶肠液;以细菌浓度为1×109CFU/mL孵育菌液0、1、2、3小时,计算不同时间点菌量变化;配制浓度为0%、1%、2%、4%的牛胆汁,以104CFU/mL、106CFU/mL、108CFU/mL菌浓度重悬孵育0、1、2、4小时,计算不同时间点菌量变化。六、毒性实验动物毒性实验:实验分为三组:中剂量(5×1010 CFU/天)组、高剂量(5×1011CFU/天)组和上清液(0.5ml/天)组,选取6-8周龄SPF级Balb/C小鼠,随机分组,按照分组灌于新鲜菌液或者是培养上清液,每天1次,连续5天,结束灌胃后观察12天,监测指标为小鼠的健康状态及体重,血常规、肝肾功能、胃肠肝脾病理。细胞毒性实验:本实验选用了一种实时、无标记、全自动,非侵袭的实时细胞分析技术(Real-time cell analysis,RTCA)检测B.fragilis细胞毒性。RTCA法是根据黏附于含有传感器的检测板上的阻抗变化来推测黏附细胞的数目、活力、增殖分裂、形态变化等情况,从而推断被检物的细胞毒性。细胞种植实验,HT-29 细胞及 LoVo 细胞以不同浓度(12×104cells/孔、6×104cells/孔、3×104cells/孔、1.5×104cells/孔、7500cells/孔、3750ells/孔、1875cells/孔)铺布于xCELLigence系统(RTCA法检测系统),不予干预;菌体(MO1=200)、菌体裂解液(MOI=200)、上清液(100ul/450ul)细胞毒性实验:B.fragilis、干酪乳杆菌(Z.casei,益生菌对照)、肠出血性大肠杆菌(EHEC,致病菌对照组)感染LoVo细胞和HT-29细胞(6×104cells/孔),对照组为培养基组,总孵育时间约80-85h。结果一、本研究对象为非产肠毒素型脆弱拟杆菌16s DNA序列比对分析结果显示与该菌株最为接近的为B.fragilis的标准株ATCC 25285。基于16s DNA序列构建系统发育树,本菌近源菌株为ATCC 25285和JCM11019。基于全基因组测序结果构建系统发育树,发现本菌与ATCC25285在同一分支上,与ATCC 25285的平均核苷酸一致性(ANI)达99.99%以上,上述结果证实本课题研究对象的确为一株B.fragilis,和ATCC25285同源。将本株B.fragilis基因的蛋白序列与ARDB、VFDB数据库进行比对(氨基酸一致性>40%),筛选出本菌可能携带的毒力相关基因和抗生素耐性基因,分别为24个毒力相关基因和11个耐药相关基因。对上述相关毒力基因分析,发现大多为细菌的荚膜、鞭毛、表面抗原等,对于其是否因此本株B.fragilis毒力表达,目前并无报道,因此暂不能认为上述基因与本菌毒力直接相关。另本株B.fragilis不含有bft基因,为非产肠毒型脆弱拟杆菌(NTBF)。比对发现本株B.fragilis耐药基因全部位于染色体上,不具有耐药性转移风险。二、形态学特性及基本特性该菌仅在37℃厌氧条件下能够正常生长,为专性厌氧菌。经过48小时固体培养后可见,菌落直径在1-3mm,圆形微凸,半透明,白色,表明光滑。无溶血现象。革兰染色发现其为革兰阴性细菌,呈现典型的杆状,两端钝圆、浓染,菌体中间不着色部分形如空泡;扫描电镜结果显示该株菌该株菌无鞭毛,无芽孢;透射电镜下可见细菌荚膜及细菌染色质,符合B.fragilis的形态学特征。该菌生长较为迅速,第8小时进入对数生长期,第16小时进入平台期。该菌在氧暴露的情况下,于0-12小时内持续增殖分裂,可存活3天或以上。说明该菌具有良好的耐氧能力,能够耐受后续的体外实验。在感染30min后,菌株的黏附率为 4.18±1.18%;60min 为 5.52±1.03%;90min 为 5.51±1.60%。经统计学分析,30min反应组、60min反应组及90min反应组间的黏附率不存在统计学差异,但黏附率随时间延长呈上升趋势。三、生理生化特性及产物分析通过生理生化反应及产物分析进一步对本株B.fragilis进行菌株鉴定,结果发现本菌和ATCC 25285对N-乙酰-D葡萄糖胺、丙氨酸、水杨苷等物质的代谢存在差异,但两者过氧化氢酶实验阳性、明胶液化实验弱阳性、无溶血、无动力。另,两者主要产物均为乳酸、乙酸、琥珀酸、丙酸和苯乙酸。四、耐药性本株B.fragilis对头孢吡肟、卡那霉素、链霉素耐药,对头孢曲松、甲氧苄啶、克拉霉素、氯霉素、左氧氟沙星及四环素均不耐药。五、耐受胃肠液胆汁该菌株在pH 2.0的人工胃液里无法存活,而在pH 3.0的人工胃液中,存活率维持在60%～97%之间,在pH 4.0人工胃液中存活率与初始无明显差异;人工肠液试验证实,人工肠液不会对该菌的生长产生抑制作用,其存活率能维持100%左右;在胆汁实验中无论菌起始浓度为多少,有无胆粉刺激,细菌均能随时间增加而明显生长,证实了其对胆汁的良好耐受性。六、本株脆弱拟杆菌具有动物安全性及细胞安全性动物毒性实验无动物死亡,中剂量(5×1010 CFU/天)菌体组及盐水组两组体重增长百分比(%)经统计学分析后p=0.46,无统计学差异;高剂量组(5×1011 CFU/天)菌体组及盐水组两组体重增长百分比(%)经统计学分析后p=0.83,无统计学差异;上清组及TSB组两组体重增长百分比(%)经统计学分析后p=0.9598,无统计学差异。高剂量菌体组小鼠与盐水组小鼠其血常规及肝肾功能、胃肠肝脾病理无明显差异。说明本株B.fragilis对小鼠无明显毒性。细胞毒性实验结果发现6×104 cell/孔的种植密度更利于观察,HT-29细胞于第12-14小时进入对数分裂期、LoVo细胞处于平台期,于该时间点攻击,便于同时观察攻毒物对细胞分裂的影响(HT-29细胞)和对细胞黏附的影响(LoVo细胞);将200倍于细胞数目的活菌悬液(B.fragilis,Z.casei,EHEC,MOI=200)、MOI=200菌体裂解液、及培养至平台期的上清液(100ul/450ul)感染细胞,结果显示,B.fragilis活菌、菌体裂解液及上清液对HT-29细胞和LoVo细胞共孵育不明显影响细胞NCI值变化,和益生菌对照或培养基对照比起曲线增长趋势无明显差异,说明B.fragil.s对这两株肠上皮细胞无明显毒性。结论1、本课题实验对象为脆弱拟杆菌,与ATCC25285同源,为非产肠毒素型脆弱拟杆菌;2、符合脆弱拟杆菌形态学特点和培养特性、具有耐氧能力和较强的黏附性能;3、生理生化特性和ATCC25285相近,主要代谢产物为乳酸、乙酸、琥珀酸、丙酸和苯乙酸;4、本菌对头孢吡肟、卡那霉素和链霉素耐药,所有耐药基因位于染色体,无抗性转移风险;5、本菌耐受人工胃液(pH 3.0)、人工肠液及胆汁,具有良好的耐受性能;6、以5×1010、5×1011CFU/天剂量新鲜菌液或培养上清液连续灌胃5天予健康小鼠,不引起小鼠死亡及体重下降,本菌具有动物安全性:将本菌、菌体裂解液(MOI=200)及上清液体外感染LoVo、HT-29细胞,未见明显毒性,本菌具有细胞安全性。