N4bp1通过调控Notch信号通路参与小鼠大脑皮层的早期发育

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在哺乳动物中,大脑是其全身所有动物器官中功能最复杂的器官,也承担着更多的职责,大脑在接受到所有来自感觉神经输入的信息后,将其进行加工并与先前存储的信息相整合,进而支配躯体产生各种运动以及社会行为,包括抽象思维、艺术和幽默感等及其具有人类特征的行为。目前的研究认为,大脑皮层与这些高级行为的产生密不可分,人类大脑皮层与其他动物相比异常发达,大脑皮层作为一个功能复杂的组织,在发育过程中经过了一系列复杂的发育过程。在这一过程种,有限数量的神经干细胞首先进行分裂增殖,其中一部分神经干细胞分化成为无数的神经元和神经胶质细胞。这些神经元和胶质细胞在发育过程中按照调控从出生部位向靠近大脑表面的最终位置进行迁移。大脑皮层神经元的迁移过程在相关因子的作用下受到严格的时空调控,在这个过程中,任何紊乱也会导致显着的异常,例如导致严重的学习缺陷、认知障碍和顽固性癫痫等都是在神经发育过程中出现了异常改变。因此研究并了解大脑皮层发育的调控机制是发育生物学中的重要命题。Notch信号通路是一个在进化上高度保守的信号通路,它参与决定了多细胞生物发育过程中的众多细胞的命运。数十年的研究表明:Notch在胚胎大脑发育过程中起着重要作用,是神经元发育的规范和基础。实验室前期工作证实N4bp1(NEDD4 binding protein 1)在大脑皮层高表达,作为一个新的Notch信号调控因子,促进神经元的发生。并且证明N4bp1是通过下调NICD的蛋白水平来实现对于Notch信号的拮抗,同样证明了 N4bp1对于NICD的降解是非依赖PEST结构域的。但是还有问题尚未解决,比如N4bp1的哪个结构域在降解NICD中起关键作用、N4bp1依赖NICD的哪个结构域将其降解、N4bp1利用哪种降解途径降解NICD、N4bp1利用哪种E3泛素连接酶使NICD降解、以及基因敲除小鼠的表型分析。针对上述问题,本研究利用免疫共沉淀技术,证明N4bp1与Notch1在体内可以结合,进一步验证发现两者存在调控关系;利用分段克隆技术,证实N4bp1通过RAM结构域降解NICD,确实非依赖PEST结构域降解;为进一步验证该结论,本研究利用GST-pull down证实N4bp1与RAM结构域体外结合;利用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,检测NICD的稳定性,证实N4bp1通过泛素-蛋白酶体途径降解NICD。另外,本课题也对N4bp1的功能结构域进行了探索。利用分子克隆相关技术,对N4bp1进行缺失突变和点突变,结果表明CUE-like结构域的缺失或862-863(FP)突变,致使N4bp1降解NICD功能的缺失,证明了 N4bp1降解NICD的关键结构域是CUE-like,其结构域的关键位点是862-863(FP)。此外,本课题利用免疫共沉淀技术,证明敲低内源性的E3泛素连接酶Trim21,对N4bp1降解NICD的功能具有一定的抑制作用,证明Trim21参与了 N4bp1对于NICD的降解。为了进一步全面认识N4bp1的功能,本研究构建了 N4bp1基因敲除小鼠,以N4bp1条件性敲除小鼠为模型,研究发现当N4bp1在大脑皮层敲除后,生发区干性细胞更加聚集于底层,未向上迁移,而野生型的干性细胞则较为分散,有向上迁移的趋势;而P3条件性敲除小鼠与野生型相比,各层次神经元没有明显变化,但皮层厚度变薄,目前未分析出原因。未来我们将针对N4bp1的敲除鼠模型进行更加细致的分析,以完善数据。
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