荧光探针由于具有操作简便、高灵敏度、良好的重现性、膜通透性、原位实时检测等系列优点,所以广泛应用在生物活性分子标记、环境分析、细胞染色和临床医学检验诊断等许多方面。此外,与荧光成像技术相结合,分子荧光探针能方便用于生物体系中目标生物活性分子的原位适时无损伤检测,并可用于监控活细胞中生物分子及其生物过程。因此,分子荧光探针日益成为现代生命科学及疾病诊断等重要领域不可缺少的一种工具。与单光子荧光成像比较,双光子染料能在活组织中进行三维成像、穿透能力强、对生物样品的光损伤较小、背景荧光干扰也较小等优点,同时双光子显微镜荧光成像技术为在活的细胞和组织中研究生物活性小分子提供了可行的分析检测方法。鉴于双光子荧光探针在生物荧光成像方面具有重大的优势,近年来双光子荧光探针的设计、开发也成了人们的一个研究的热点。而探索具有优良的光化学物理性质和大的双光子吸收截面的双光子荧光染料是目前开发荧光探针所面临的巨大挑战。在本文中,主要工作是设计和修饰有机小分子荧光染料,构建具有重要生物意义的一氧化碳、次硝酸双光子荧光探针和硫化氢单光子荧光探针。具体内容包括以下几个方面:（1）合理设计、合成了一系列咔唑-香豆素衍生物（CC-1⁷）,其部分衍生物具有良好的双光子光谱性质,同时其荧光性质可通过香豆素骨架上4-位的结构修饰（重原子或者重金属）来调控荧光。因此,这类新颖的染料是发展双光子荧光“关-开”成像探针的理想选择。在此基础上,进一步开发了第一个双光子一氧化碳荧光探针CC-CO,该探针对一氧化碳的响应表现出高选择性,良好的膜通透性以及适用于较广的p H值范围等优点。并将其成功应用于细胞和活体组织中一氧化碳的双光子成像研究。（2）利用近红外光激发的氧杂蒽类双光子荧光染料GCTPOC,基于次硝酸与三苯基膦特异性反应位点,开发了第一个双光子次硝酸荧光增强型探针GCTPOC-1,该探针对次硝酸的响应表现出大的荧光增加倍数（49倍）,高选择性,高灵敏度,良好的膜通透性。并将其成功应用于人宫颈癌（HeLa）细胞和活体小鼠肝脏组织中次硝酸的双光子成像研究。（3）以菲并咪唑为荧光染料,利用叠氮基团吸电子淬灭染料荧光的性质,构建了以菲咪唑为荧光骨架的硫化氢荧光“关-开”型探针PI-N₃,探针PI-N₃对硫化氢的响应表现出大的荧光增加倍数（20倍）,高选择性,高灵敏度,良好的膜通透性以及适用于较广的pH值范围。并将其成功应用于HeLa细胞中硫化氢成像研究。（4）通过对Bodipy荧光团的结构修饰,合成了一种新的近红外荧光染料。再利用硫化氢硫解二硝基苯基醚的机理,设计并合成了一个近红外荧光增强型的探针NIR-H₂S,探针对硫化氢的响应表现出大的荧光增加倍数（18倍）,高选择性,高灵敏度,低的检测下限（5×10-8 M）,良好的膜通透性以及适用于较广的pH值范围。荧光成像实验证明了该荧光探针NIR-H₂S能在活HeLa细胞内对硫化氢进行成像。