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我国长期采用灭活疫苗防控H9N2亚型禽流感,然而该病依然广泛流行,尤其在2010-2013年期间,我国免疫鸡群中H9N2亚型禽流感呈现加剧发生的现象。之前的研究结果显示,1994年-2008年鸡群中流行的H9N2亚型流感病毒可分为3个抗原群(C、D、E群)。然而对2009年以后我国流行的H9N2亚型禽流感病毒的抗原性缺乏系统的研究。因此,对近年H9N2亚型禽流感病毒的抗原性进行系统研究,对科学防控该病具有重要意义。本研究利用中和试验和HI试验种抗血清研究了26株分离自2009-2013年的H9N2距型禽流感病毒的抗原特性,结果发现只有2株分别属于2008年前主要流行毒株形成的抗原群D和E,其它24株病毒形成了新型抗原F群,而且F群病毒的抗原性也存在一定差异,可进一步分成3个亚群。此外2009-2013年期间分离的病毒与用于鸡群的商业疫苗抗体反应很差,这是H9N2亚型禽流感病毒在2010年以后于全国范围内免疫鸡场中频繁发生的主要原因。为了进一步探究H9N2亚型禽流感病毒发生抗原性变异的原因,我们分析了H9N2流感病毒HA基因演化特点和规律。研究发现,2009-2013年期间流行的H9N2亚型流感病毒在HA基因上发生了15个稳定突变,其中9个位于已知HA抗原表位。病毒HA获得的稳定突变可能是病毒发生抗原变异形成F抗原群、逃避疫苗免疫抗体的原因。通过HI试验和中和试验,发现Ck/HeB/YT/10 (YT)抗血清与C、D、E、F抗原群毒株的反应均较好,因此,我们选择了YT作为疫苗候选株,评价了由YT制备的灭活疫苗对不同抗原群H9N2病毒的免疫保护效果。结果显示,免疫鸡的HI抗体滴度在26-29时,病毒感染后口腔、泄殖腔病毒的分离率和病毒滴度均显著降低,并且病毒的传播效率也显著降低。免疫鸡HI抗体滴度在210-212时,免疫鸡在感染不同抗原群病毒后,其口腔和泄殖腔中均检测不到排毒。以上结果说明,有必要持续地对H9N2亚型流感病毒的抗原性、基因演化规律进行研究,密切监视流行毒株的抗原性变化和疫苗对流行株的免疫效力,以制订科学的H9N2禽流感病毒防控措施。由于禽流感病毒的抗原性容易发生变异,使得灭活疫苗在防控H9N2亚型禽流感中有一定局限性或滞后性；利用弱毒疫苗,使之能够同时产生细胞免疫和体液免疫是防控禽流感的新方法。已有研究证明流感冷适应减毒活疫苗(live attenuated influenza vaccine,LAIV)免疫小鼠能够产生对不同亚型流感病毒的交叉免疫保护,但其在鸡体内是否也具有交叉免疫保护效力未知。由于2010年后H5N2亚型禽流感病毒在我国家禽中发生,并给我国养禽业带来严重经济损失,所以在本研究进一步探究了之前本实验室制备的一株H9N2亚型冷适应减毒活疫苗能否用于防控异亚型流感病毒即H5N2亚型流感病毒的防控。鸡只免疫保护试验表明,该疫苗免疫能够抑制H5N2病毒在鸡只气管、肺脏和肾脏中的复制;当感染致死剂量的H5N2亚型流感病毒时,H9N2LAIV免疫组鸡只存活率为100%。病毒特异性T细胞研究结果显示,H9N2LAIV能够诱导识别H5N2病毒的IFN-y+CD4+T细胞和IFN-y+CD8+T细胞；免疫组识别H5N2病毒的IFN-y+CD4+T细胞和IFN-y+CD8+T细胞水平从4dpi开始显著高于对照组,这与免疫组鸡只的肺脏发生病毒清除、病毒滴度显著低于对照组的时间一致,暗示病毒特异性T细胞在病毒清除中的作用。抗体测定结果显示,H9 LAIV免疫血清中没有与H5N2亚型流感病毒反应的HI和中和抗体,但通过ELISA可以检测到交叉结合H5N2亚型流感病毒的IgG抗体。因此,H9N2LAIV在鸡体内能够产生对H5N2病毒的交叉免疫保护效力,识别H5N2亚型流感病毒的特异性T细胞和非中和抗体可能在抵抗H5N2亚型流感病毒的感染中发挥重要作用。为了进一步揭示H9N2冷适应疫苗对H5N2亚型禽流感病毒的交叉免疫保护机制,我们将H9N2 LAIV免疫血清对SPF鸡进行被动免疫,然后感染致死剂量的H5N2亚型流感病毒,结果发现H9N2LAIV免疫血清组的鸡存活率为100%,而未免疫感染组的鸡全部死亡,说明H9N2LAIV免疫血清被动免疫能够产生对H5N2亚型流感病毒的交叉免疫保护。比较H9N2LAIV免疫血清和与其同源的灭活疫苗的免疫血清被动免疫对H5N2亚型流感病毒的交叉免疫保护效果以及两种血清中NP蛋白特异性IgG抗体水平,发现H9N2LAIV免疫血清对H5N2亚型流感病毒的交叉免疫保护效率为100%,而注射灭活疫苗免疫血清的鸡在感染H5N2病毒后则全部死亡。LAIV诱导的NP特异性IgG抗体水平高于灭活疫苗。当对SPF鸡同时进行灭活疫苗血清和NP蛋白免疫血清被动免疫,使其NP IgG抗体水平与LAIV组相似时,免疫鸡在H5N2亚型流感病毒感染后的存活率上升至40%。该研究表明,弱毒疫苗免疫血清能够产生对异亚型病毒的交叉免疫保护,并且交叉免疫保护作用可能与弱毒疫苗诱导产生的NP特异性IgG抗体水平有关。这为弱毒疫苗用于异亚型/抗原漂变病毒的防控提供了新的理论支持。综上,本研究解析了2010-2013年H9N2亚型流感在我国免疫鸡群中加剧发生原因,发现H9N2病毒形成了新的抗原群即F群；进一步研究发现冷适应弱毒疫苗能够在鸡体内诱导对异亚型H5N2亚型流感病毒的交叉免疫保护,并揭示了弱毒疫苗诱导产生的特异性T细胞和NP特异性IgG抗体是弱毒疫苗免疫血清能够对异亚型病毒交叉免疫保护的原因之一。因此,本研究丰富了我国H9N2亚型禽流感分子流行病学内容,并对禽流感的防控有重要指导意义。