[研究背景]肿瘤靶向分子成像是近年来分子影像学研究的热点。肿瘤靶向分子成像是利用分子探针可特异性识别肿瘤靶点,并与肿瘤组织特异性结合,在体外利用相应的显像设备进行活体成像,提高肿瘤探测的灵敏度及特异性。目前,肿瘤靶向分子成像常用的蛋白类分子探针为抗体类和多肽类,而各有其不足。抗体类分子探针不足主要为：①分子量大,易发生聚集反应；②组织穿透力低,不易进入实体肿瘤内部；③抗体制备过程复杂、生产成本高：④固有免疫原性,体内注入抗体可能引起免疫反应。多肽类分子探针不足主要为：①多肽在体内半衰期短,易被蛋白酶降解;②多肽生产主要依靠化学合成,费用较高；③经化学修饰标记后,多肽的靶向效能易受到影响。近年来,合成文库和筛选技术为新型特异性分子的筛选提供了非免疫学的方法。通过合成文库和体外筛选技术获得的高亲和力和高特异性结合分子,例如,预设计锚蛋白重复蛋白(Designed ankyrin repeat proteins, DARPins)、 AdNectins、 Affibodies、 Anticalins等。其中,DARPins分子小、稳定性高,可在大肠杆菌胞质内表达,且表达产率高,生产成本低,方便易得,与靶分子具有高度的亲和力和特异性,有利于克服抗体和多肽的不足。DARPins是天然重复蛋白的衍生物,一般由4-6个氨基酸的重复序列构成,分子量约为14-21KDa(单一重复序列由33个氨基酸残基构成)。通过随机残基和重复序列的组装,可以产生多样化的复杂的DARPins文库；应用生成的DARPins文库识别同种抗原,可以筛选出具有高特异性和高亲和力的结合分子。2006年,Zahnd C等利用核糖体展示技术筛选出了多种靶向HER2细胞外域的DARPins.2007年,Zahnd C等利用核糖体展示技术又筛选出了针对HER2高度特异性的DARPin H10-2-G3(简写为G3)。通过定点突变的方法在DARPin G3的C末端帽的倒数第二位引入半胱氨酸,有利于多种物质的定点标记,如荧光素、纳米颗粒、放射性核素及毒素等。而突变位点离DARPin G3的活性区域较远,形成的突变体仍可保持原有的生物学功能。人表皮生长因子受体2 (human epidermal growth factor receptor2, HER2),是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白,具有细胞内酪氨酸激酶结构域和细胞外配体结合结构域。正常情况下,HER2与人表皮生长因子受体家族的其他成员(EGFR、HER3及HER4)形成异二聚体发挥信号转导功能,在细胞生长、存活和分化过程中起重要作用。当HER2突变或过度表达,可能直接导致细胞的恶性转化和转移；阻断HER2信号转导通路和抑制HER2的活性,可以抑制肿瘤生长,诱导肿瘤细胞凋亡。研究显示,在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌和前列腺癌中均存在不同程度的HER2过表达；目前,针对HER2的靶向治疗药物已广泛用于临床；临床研究表明,HER2过度表达预示患者预后差。临床检测HER2表达的方法主要通过组织学方法,包括免疫组化(IHC)、荧光原位杂交(FISH)和显色原位杂交(CISH)3种,均无法实现在体、实时、动态监测HER2表达状态。近年来,针对特定分子的肿瘤靶向成像技术不断发展,为可视化实时、动态监测活体状态下HER2的表达提供了可能。为实现靶向HER2的分子影像诊断,本课题以可与HER2高度特异性结合的DARPin H10-2-G3(简写为G3)为靶向性配体,以放射性核素18F为标记信号,制备分子探针18F-G3,用于PET显像实现在体、实时、动态监测HER2表达状态。本课题拟通过活体外的细胞学、病理学实验,活体内的荧光成像实验、小动物PET/CT显像实验,验证该显像方法的可行性。如果这种新型靶向HER2 PET显像方法得以实现,为乳腺癌治疗方案的选择及预后判断建立一种新的分子影像方法,推测也可用于针对HER2的靶向药物的研发；也可为新型DARPins类分子探针的研发提供理论和实践依据。[实验目的]1.原核表达系统制备靶向HER2的预设计锚蛋白重复蛋白DARPinH10-2-G3,对其进行纯化和鉴定,为分子探针的制备及未来临床应用奠定基础；合成荧光分子探针G3-5-MF,对其进行纯化和鉴定,并通过体外细胞学、病理学实验及动物断层荧光成像验证DARPin G3的HER2靶向性,探讨DARPin G3作为探针配体的可行性。2.基于GE模块TRACERlab FXFN亲核氟化反应合成系统合成标记辅助基团18F-2-氟丙酸对硝基苯酯(18F-NFP),再与预设计锚蛋白重复蛋白DARPin H10-2-G3反应得到放射性核素分子探针18F-G3,通过荷乳腺癌裸鼠的Micro-PET/CT显像研究,探讨分子探针18F-G3用于肿瘤体内靶向成像和在体评价HER2表达状态的可行性。[实验方法]1.预设计锚蛋白重复蛋白DARPin H10-2-G3的表达和纯化在NCBI数据库中搜索到与目的蛋白DARPin G3相似度为92%、已公布基因序列的蛋白,其NCBI序列号为AM997265,将其中20个不一致的碱基,采用同义优势密码子的方法替换,以获得在大肠杆菌中高表达目的蛋白的基因序列,另定点突变了第135位氨基酸为半胱氨酸。通过PCR技术克隆了DARPin G3基因,经酶切鉴定及序列分析表明其序列与设计的序列完全一致。将该片段亚克隆到表达载体pET32a (+),转化BL21,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析及质谱检测。所得产物通过Ni2+-NTA His · Bind Resins纯化试剂盒纯化,最终得到高纯度的DARPin G3。2.分子探针G3-5-MF的合成荧光素-5-马来酰亚胺(Fluorescein-5-maleimide, 5-MF)的马来酰亚胺环上的双键可以与DARPin G3氨基酸序列C端倒数第二位突变的半胱氨酸残基上的巯基(-SH)部分形成共价交联,制备荧光分子探针G3-5-MF。合成产物经3K超滤离心管分离、纯化。3.分子探针G3-5-MF体内外生物学功能的评价(1)荧光探针G3-5-MF与人乳腺癌组织的体外结合实验自乳腺外科获得人乳腺癌组织,制作石蜡切片；经常规脱蜡、微波修复、BSA封闭后,每张切片加入兔抗人HER-2抗体50微升,37℃孵育2小时；甩去PBS,加入生物素标记山羊抗兔IGg,50微升,37℃孵育40分钟,加入辣根酶标记的亲和素工作液,37℃孵育40分钟,PBS冲洗三次,DAB显色,苏木素复染10分钟,脱水封片,显微镜观察,照片：取与免疫组化实验所用石蜡切片的相邻层面切片,经常规脱蜡、微波修复、BSA封闭后,每张加入G3-5-MF PBS溶液(2x10-3mg/mL) 50微升,避光孵育30分钟,PBS冲洗三次,倒置荧光显微镜观察,照片；相邻层面的免疫组化照片与荧光显微镜照片融合,验证DARPinH10-2-G3的靶点是否为HER2受体。(2)荧光探针G3-5-MF与肿瘤细胞的体外结合实验常规培养人源性乳腺癌细胞SKBR-3、MCF-7、MDA-MB-231。用兔抗人HER-2抗体对上述三种肿瘤细胞进行HER2表达状态的检测；将肿瘤细胞与荧光探针G3-5-MF结合,置于倒置荧光显微镜下观察细胞内荧光素的分布；流式细胞仪分析相对细胞荧光强度。将G3-5-MF和兔抗人HER-2抗体先后孵育SKBR-3细胞,进行竞争抑制实验,通过两种不同荧光的分布及程度观察两者之间是否存在竞争抑制情况。(3)荧光探针G3-5-MF靶向HER2表达阳性肿瘤动物显像实验常规方法建立乳腺癌SKBR-3皮下移植瘤裸鼠模型23只。当肿瘤直径超过0.5cm时,随机取出7只,经鼠尾静脉注射G3-5-MF(2.5mg/ml,150μl),分别于Oh、1h、4h、6h、8h、10h、24h后脱颈处死裸鼠,分离肿瘤及各组织脏器,置于干净的玻璃平皿上,用荧光显像仪进行显像,观察随时间变化,肿瘤及各脏器的荧光分布情况；取正常裸鼠1只,经鼠尾静脉注射G3-5-MF,4h后脱颈处死裸鼠,分离各组织脏器作为空白对照。取12只乳腺癌动物模型,随机分为2组,即1小时显像组和4小时显像组。每组分别随机取3只经鼠尾静脉注射荧光分子探针G3-5-MF (2.5mg/ml,150μl),另3只注射PBS(150μl)。于注射1小时和4小时后脱颈处死裸鼠,置于-80℃冰箱迅速冷冻2h,用切割机进行冠状断层切层,将切层后的动物切片平放于干净的玻璃平皿上,用荧光显像仪进行显像,观察肿瘤及各脏器的荧光摄取情况,测量肿瘤的荧光摄取值,比较两组裸鼠肿瘤荧光摄取值的差异。显像后分离肿瘤,置于-800℃冰箱迅速冷冻30min,制作冰冻切片,经DAPI复染后,于荧光显微镜下观察绿色荧光分布。4.分子探针18F-G3的合成及PET/CT显像研究(1)合成PET分子探针18F-G3从2-溴丙酸乙酯出发,经18F-亲核取代、氢氧化钾水解,再与二(对硝基苯)碳酸酯(NPC)、反应得到活化的放射性标记辅助基团18F-NFP; 18F-NFP与DARPin G3在无水二甲基亚砜(DMSO)溶剂中,以N,N-二异丙基乙基胺(N,N-diisopropylethylamine, DIPEA)为碱,40℃下反应20min,多步骤反应合成了18F-G3。得到产品后采用TLC测放射化学纯度,活度计测放射性活度,计算放化产率。(2)PET分子探针18F-G3的荷乳腺癌裸鼠的Micro-PET/CT显像常规方法建立乳腺癌SKBR-3皮下移植瘤裸鼠模型3只,当肿瘤直径超过0.5cm时,作为实验动物。经裸鼠尾静脉分别注射3.70～5.55MBq (100～150μCi)18F-G3,于30min、60min、120min、200min后,进行Micro-PET/CT静态显像,利用Inveon Research workplace (IRW2.2)工作站进行数据处理,PET数据经CT衰减校正后利用滤波反投影法,重建冠状面、横断面、矢状面断层图像进行分析,并与CT图像进行融合,手动勾画肿瘤感兴趣区,工作站自动计算SUVmax。[实验结果]1.预设计锚蛋白重复蛋白DARPin H10-2-G3的表达和纯化原核表达系统表达并分离、纯化后得到的DARPin G3为无色透明状液体,经真空干燥仪干燥后为白色粉末。经SDS-PAGE分析,在15KD处有一个明显的条带；质谱分析鉴定主峰分子量为14634,与文献报道分子量14.5KD相符,且检测到有两个肽段序列与DARPin G3相匹配,提示合成正确。2.分子探针G3-5-MF的合成合成的G3-5-MF为荧光黄色液体,荧光分子探针G3-5-MF可用于体内外的验证实验。3.分子探针G3-5-MF体内外生物学功能的评价(1)荧光探针G3-5-MF与人乳腺癌组织的体外结合实验免疫组化实验证实HER2(+++)、HER2 (+)和HER2阴性标本。荧光分子探针G3-5-MF与人乳腺癌组织的结合实验：HER2(+++)的标本,镜下有明显绿色荧光在组织中呈弥漫性分布；HER2(+)标本,镜下仅有少许绿色荧光分布；HER2阴性标本,镜下未见绿色荧光分布。由此证实预设计锚蛋白重复蛋白DARPin H10-2-G3可与HER2阳性人乳腺癌组织特异性结合,并且其分布与HER2一致。(2)荧光探针G3-5-MF与肿瘤细胞的体外结合实验HER2抗体免疫细胞荧光实验：在SKBR-3细胞膜上出现明显红色荧光,在MCF-7细胞膜上有微弱的红色荧光,验证了SKBR-3细胞过表达HER2,MCF-7可疑表达HER2：而在MDA-MB-231细胞膜上未出现红色荧光,提示此细胞不表达HER2。荧光探针G3-5-MF孵育肿瘤细胞后,倒置荧光显微镜观察：在SKBR-3细胞膜上出现明显绿色荧光,提示该探针可以与SKBR-3细胞结合；而在MCF-7和MDA-MB-231细胞膜上未出现绿色荧光,提示该探针不可与上述细胞结合。流式细胞仪分析：经加入荧光探针G3-5-MF的培养液孵育,SKBR-3细胞有明显荧光摄取,而在MCF-7和MDA-MB-231细胞的荧光分布曲线较空白对照的MCF-7和MDA-MB-231细胞的曲线,位置分布仅有轻微的右偏(MCF-7细胞右偏程度较MDA-MB-231细胞稍明显),提示G3-5-MF不与上述两种细胞结合。SKBR-3的竞争抑制实验：G3-5-MF探针的绿色荧光程度和HER2抗体的红色荧光程度较各自单独孵育时,均有所减弱,两种荧光的融合图显示,红色荧光和绿色荧光在细胞膜上存在互补关系。(3)荧光探针G3-5-MF靶向HER2表达阳性肿瘤动物显像实验荷乳腺癌SKBR-3裸鼠肿瘤及各脏器荧光成像显示：Oh显像肿瘤有明显荧光摄取；1h、4h、6h、8h及10h显像肿瘤组织均有荧光摄取,在4h呈荧光摄取最强,之后,随时间推移荧光强度逐渐减弱,24h显像肿瘤几乎无荧光摄取；脏器显像方面,肾脏、胆囊有明显荧光摄取,胃肠道、肌肉、脑有中等强度荧光摄取,肝脏、脾脏、心脏、肺脏有轻微荧光摄取；正常裸鼠各脏器荧光分布同上。荷乳腺癌SKBR-3裸鼠肿瘤冠状断层切片荧光成像显示：1h和4h,注射荧光探针G3-5-MF的裸鼠,其肿瘤组织均有荧光摄取,注射PBS的裸鼠,其肿瘤组织未见荧光分布；且4h荧光分布高于lh。定量比较两组肿瘤的荧光摄取值：1小时组肿瘤荧光摄取值为(3273.50±901.68),4小时组肿瘤荧光摄取值为(6634.83±662.08),两组肿瘤荧光摄取值有显著性差异(t=-7.360；P<0.001)。冰冻切片的荧光显微镜观察结果与冠状断层切片显像结果相似。4.分子探针18F-G3的合成及PET/CT显像研究(1)合成PET分子探针18F-G3用GE模块Tracerlab FXFN制备了常用辅助基团18F-NFP。2-溴丙酸乙酯经过亲核氟化、KOH水解和NPC活化三步“一锅法”反应制得初步的18F-NFP,再用半制备柱液相分离得到放化纯>98%的18F-NFP。其衰变校正后的产率为26%,耗时100 min。干燥的18F-NFP与蛋白DARPin G3偶联再经过固相柱PlusC18分离纯度化,成功得到放化纯>98%的18F-G3,其衰变校正后的总产率为(5±2)%(n=3,从18F开始计算)。(2)PET分子探针18F-G3的荷乳腺癌裸鼠的Micro-PET/CT显像荷乳腺癌SKBR-3皮下移植瘤裸鼠模型的Micro-PET/CT显像：30min显像,肿瘤组织见放射性浓聚,心脏、肝脏、双肾及肠道内见放射性浓聚,血液本底较高,胆囊内见明显放射性浓聚,肠道及肾脏的摄取值较高,表明18F-G3主要经肝胆及泌尿系统代谢；脑未见放射性分布,表明18F-G3可能无法通过血脑屏障；60min显像,肿瘤组织内放射性浓聚增加,心脏、肝脏、双肾及肠道内放射性浓聚亦增加；120min和200min显像,肿瘤组织内放射性分布进一步增加,而心脏、肝脏、双肾及肠道内放射性分布逐步减低。注射18F-G3 30min后肿瘤SUVmax为1.5,60min后SUVmax为1.9,120min后SUVmax为2.1,200min后SUVmax为2.2。[结论]1.本研究采用原核表达系统制备靶向HER2的预设计锚蛋白重复蛋白DARPin H10-2-G3, SDS-PAGE分析及质谱检测证实表达正确。2.用荧光素-5-马来酰亚胺标记DARPin H10-2-G3,合成荧光分子探针G3-5-MF:体外细胞学实验证实荧光分子探针G3-5-MF可与HER2表达阳性细胞结合,且结合程度与HER2表达状态呈正相关。荷HER2过表达乳腺癌SKBR-3裸鼠的荧光生物分布实验证实荧光分子探针G3-5-MF在活体内可与肿瘤组织特异性结合,具有HER2靶向性。3.通过合成含活化羟基的标记辅基18F-NFP,与DARPin H10-2-G3的侧链氨基反应,合成PET分子探针18F-G3,放射化学纯度大于98%,为进一步的临床应用奠定了基础。4.荷乳腺癌SKBR-3皮下移植瘤裸鼠模型Micro-PET/CT显像研究实验表明分子探针18F-G3在活体内特异性靶向乳腺癌中表达HER2的肿瘤组织,可用于PET显像诊断HER2的表达状态。