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恶性肿瘤严重影响人类的生命健康,发病率和死亡率不断的上升,已经发展成为一类主要的公共安全问题。肿瘤的生长过程复杂,单一的治疗方式无法实现理想的治疗效果,联合治疗逐渐成为肿瘤治疗研究的热点。其中,化学免疫联合治疗是目前肿瘤联合治疗中一种重要的联合方式。与化学治疗联合的免疫治疗方式主要有肿瘤疫苗、免疫检验点抑制剂及细胞因子等,主要特点是采用不同的药物分子进行联合,从而产生协同作用以提高治疗效果。多种药物分子联合应用面临一系列的挑战,如不同药物在体内分布存在差异性、肿瘤靶向性不足及毒副作用等,在一定程度上减弱了联合治疗效果。因此,在化学免疫联合治疗的基础上,选择一种合理的联合治疗方式以实现最优的治疗效果是化学免疫联合治疗所面临的重要挑战。细胞治疗是一种新型的肿瘤免疫治疗方式,将具有治疗作用的细胞直接输入患者体内,从而激活机体的抗肿瘤免疫反应,实现肿瘤治疗的效果。目前应用于细胞治疗的细胞主要有T细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)等。细胞本身能感知复杂的机体环境,只在特定环境下才能被激活并发挥相应功能,与传统的药物分子相比具有特异性高及副作用小等优势。目前一系列基于细胞治疗的联合治疗方式被研究应用,如将CAR-T细胞与细胞因子、肿瘤疫苗及免疫检查点抑制剂等联合应用,以增强细胞治疗的效果。巨噬细胞是一种重要的细胞治疗工具。巨噬细胞是肿瘤组织中一类含量丰富的免疫细胞,能够参与肿瘤免疫反应,在肿瘤生长的过程中发挥重要作用。巨噬细胞被招募到肿瘤组织后,受肿瘤微环境刺激主要分化为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞能够分泌具有免疫促进作用的细胞因子,如肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素-12(Interleukin 12,IL-12),发挥抗肿瘤免疫作用,能够抑制肿瘤的生长。M2型巨噬细胞可以分泌具有免疫抑制作用的细胞因子,如转化生长因子-β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)和白介素-10(Interleukin 10,IL-10),抑制抗肿瘤免疫反应,从而促进肿瘤发生发展。在体外对巨噬细胞进行改造,将具有免疫治疗功能的M1型巨噬细胞回输到机体内,对于肿瘤免疫治疗具有重要意义。细胞介导的药物递送系统是一种新型的药物递送系统,其以特定的细胞作为药物递送载体,利用细胞的天然靶向功能,将药物运输至病变部位,与传统的纳米载药系统相比,具有免疫原性低和毒副作用小,可有效避免药物被网状内皮系统清除,延长药物在体内的滞留时间,增强药物在肿瘤部位蓄积等优点。目前应用的细胞载体包括红细胞、巨噬细胞及干细胞等。其中巨噬细胞是一类被广泛应用的细胞载体。巨噬细胞具有天然靶向性,在趋化因子2(C-C chemokineligand 2,CCL2)等趋化因子的作用下,能够靶向至肿瘤组织。同时巨噬细胞是一类重要的吞噬细胞,吞噬能力强。因此,选择巨噬细胞作为化疗药物递送载体,能够提高药物在肿瘤部位的蓄积量,降低因化疗药物的全身分布而引起的毒副作用,从而增强药物治疗效果。综上,本课题提出了“细胞-药物一体化”策略,即以具有免疫治疗功能的M1型巨噬细胞作为化疗药物的递送载体,构建M1型巨噬细胞介导的靶向与化学免疫联合治疗递送体系。一方面M1型巨噬细胞作为免疫治疗的工具,能够改善肿瘤免疫抑制微环境,发挥抗肿瘤免疫作用;另一方面,M1型巨噬细胞作为化疗药物的递送工具,能将化疗药物靶向递送至肿瘤部位,提高化疗药物在肿瘤部位的蓄积,从而提高化学治疗效果。基于以上治疗策略,课题具体设计如下:构建载索拉非尼脂质纳米粒(Sorafenib loaded Lipid nanoparticles,SLNP)的 M1 型巨噬细胞递送体系(M1/SLNP),用于肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)的治疗。索拉非尼(Sorafenib,SF)是被FDA批准用于临床HCC治疗的化疗药物。趋化因子CCL2在肝肿瘤部位高表达,M1型巨噬细胞在CCL2的趋化作用下能够靶向至肿瘤部位。本课题采用脂质纳米粒(Lipidnanoparticles,LNP)包载SF,构建载SF的脂质纳米粒SLNP,然后再利用M1型巨噬细胞包载SLNP。LNP具备载药量高、制备工艺简单及生物相容性好等特点,在化疗药物SF与巨噬细胞之间建立了屏障,避免了 SF与巨噬细胞的直接接触,从而减弱了 SF对巨噬细胞的毒性,使巨噬细胞能够维持正常的生理功能和免疫治疗功能。主要研究内容及结果如下:第一章索拉非尼含量测定方法的建立采用高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)法建立了 SF含量测定方法学,方法学考察结果说明HPLC法专属性良好,线性良好,日内、日间精密度及回收率均符合方法学要求,可以用于SF含量测定。第二章载索拉非尼脂质纳米粒的M1型巨噬细胞(M1/SLNP)递送体系制备及表征利用纳米沉淀法制备SLNP,并对其进行处方优化。筛选出7.5mg/mL为最优磷脂浓度,12:100为最优药脂比。SLNP载药量是5.58±0.41%,平均粒径是67.63±5.02nm,透射电镜结果显示SLNP粒径分布均匀,形态圆整。采用孵育法制备 M1/SLNP,M1/SLNP 的载药量为 38.18±0.80μg/106 细胞。M1/SLNP 表型分析结果表明经过LPS刺激后,M1/SLNP组中M1型巨噬细胞的比例明显提高。对M1/SLNP分泌细胞因子的能力进行考察,结果表明经过LPS刺激后,M1/SLNP分泌免疫促进性细胞因子IL-12及TNF-α的能力显著提高。对M1/SLNP的体外释放特性进行评价,在72 h内SF从M1/SLNP中的累计释放率为48.4%,结果表明SF能从M1/SLNP中释放。从M1/SLNP中释放的SF以游离药及脂质纳米粒两种形式存在。第三章M1/SLNP的靶向递送能力及肿瘤深层渗透能力评价对M/SLNP及M1/SLNP的肿瘤靶向递送能力进行评价,验证了 M/SLNP及M1/SLNP均能靶向至肿瘤部位,能够提高肿瘤部位药物蓄积量。对M1/SLNP的肿瘤深层渗透能力进行体内外评价,表明M1/SLNP具有肿瘤深层渗透能力。第四章M1/SLNP化学免疫联合治疗效果的评价采用MTT实验考察肿瘤细胞的毒性,结果表明M1/SLNP能够提高SLNP在肿瘤细胞上的毒性。对M1/SLNP进行体内药效评价,M1/SLNP组肿瘤体积明明显比SLNP组的肿瘤体积小(p<0.01),表明M1/SLNP具有较好的体内抗肿瘤效果。H&E染色及Ki67染色结果显示M1/SLNP能有效地抑制肿瘤细胞增殖。免疫学评价实验结果显示,M1/SLNP能够增加肿瘤组织中M1型巨噬细胞、CD3+CD8+T细胞及CD3+CD4+T细胞的比例,降低肿瘤组织中调节性T细胞(Regulatory cells,Treg)比例,提高 IL-12 和 TNF-α 的含量,表明 M1/SLNP 能够改善肿瘤免疫抑制微环境。对M1/SLNP进行安全性评价,结果显示其初步安全性良好。综上,本课题选择具有免疫治疗及靶向功能的M1型巨噬细胞,构建了 M1型巨噬细胞介导的药物递送体系。M1型巨噬细胞作为化疗药物的递送载体,能够增强化疗药物在肿瘤部位的蓄积,从而增强化学治疗效果;同时M1型巨噬细胞作为免疫治疗的工具,发挥抗肿瘤免疫作用,能够改善肿瘤免疫抑制微环境,从而实现了化学免疫联合治疗,增强肿瘤治疗效果。