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绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)是引起山羊和绵羊特别是羔羊增生性间质性肺炎的主要病原之一,其所致山羊支原体肺炎常造成山羊养殖业的重大经济损失。自1972年首次分离鉴定Mo后,Mo已呈全球性分布,我国山东、新疆、广西等地皆有Mo感染山羊病例报道,我省也于不同地区分离到Mo地方流行株。关于Mo所致山羊呼吸系统疫病的防控一直是各地难题,也是本病研究热点。本文拟通过不同方法测定主要防控药物对Mo贵州流行株的抑菌效果,筛选防控药物,为临床病例防控提供可行性方案;并针对Mo外膜蛋白P30基因开展生物信息学分析及基因疫苗研究,以期为Mo新型疫苗的研究奠定基础。1.Mo贵州株药物敏感性以Mo贵州分离株为研究对象,选取喹诺酮类、四环素类、氨基糖苷类等12种常用抗菌药及酚类、季铵盐类、含氯类等6种环境消毒药,并采用微量稀释法、酶标仪检测法分析Mo标准株Y98及Mo-GZTZ、Mo-GZWN分离株药物敏感性。其中盐酸环丙沙星、恩诺沙星、磺酸强力霉素、富马酸泰妙菌素和甲磺酸单诺沙星对Mo标准株和分离株均具有较强抑制作用,此结果表明此5种高敏抗菌药可作为防治贵州省Mo流行株首选药物;苯酚、新洁尔灭和二氧化氯对Mo标准株和分离株均具有较强杀菌作用,其中苯酚作用效果最佳,此结果表明此3种高敏消毒药可应用于临床防控贵州省Mo流行株环境消毒药。2.Mo贵州株P30基因生物信息学分析提取Mo培养物总DNA,应用PCR方法对P30基因片段进行扩增,纯化目的基因与T克隆载体连接,构建重组质粒p MD19T-P30,经PCR和双酶切鉴定为阳性重组质粒后进行测序与生物信息学分析。结果表明,通过PCR扩增均获得Mo标准株和分离菌株的P30基因片段,T克隆、测序获得了各菌株的P30基因核酸序列。序列比对结果显示,Mo分离株与标准株P30基因序列相似性分别为GZHZ:99.1%;GZKY:94.9%;GZQX:99.4%;GZXS:99.3%,分离株均存在多位点突变或缺失。通过对序列同源性分析表明,Mo分离株与SC01同源性在72.2%~76.3%之间;Mo分离株与Mhp同源性在72.9%~78.0%之间;Mo分离株与Mf同源性在73.5%~79.8%之间,而与其他种支原体同源性均在30.0%以下。以P30基因推导的氨基酸序列生物信息学分析可见,P30基因可编码285个aa;二级结构预测其无规则卷曲较少;根据蛋白亲水性、柔韧性、表面可极性及抗原指数分布区域综合分析,3个可能的优势抗原表位,分别位于3~58、80~154、183~268区域。3.Mo P30基因与Hsp70基因真核重组质粒的构建以p MD19T-P30、p MD19T-Hsp70质粒为模板,根据SDM原理设计引物,应用OE-PCR方法扩增目的基因,将突变序列定向克隆至真核表达载体pc DNA3.1(+)并构建真核重组质粒pc DNA3.1-P30、pc DNA3.1-P30-Hsp70。分别以pc DNA3.1-P30组、pc DNA3.1-P30-Hsp70组、空白对照组、pc DNA3.1(+)空载体组免疫小鼠,应用ELISA方法分析不同免疫组对小鼠细胞免疫应答的影响。结果显示,重组质粒组均可引起小鼠血清中细胞因子INF-γ、IL-2分泌水平的增强与空白对照组比较差异极显著(P<0.01),与空载体组比较差异显著(P<0.05);同时重组质粒均可引起小鼠血清中细胞因子IL-4分泌水平的下降与空白对照组和空质粒组比较差异显著(P<0.05);而空白对照组和空质粒组之间差异不显著,且融合重组质粒与单基因重组质粒比较差异显著(P<0.05)。