研究背景哮喘已成为严重威胁公众健康的慢性疾病。近年来,尽管卫生条件和医疗水平逐步改善,支气管哮喘的患病率仍呈上升趋势,相当一部分哮喘患者即使应用目前所有的治疗方法,依然无法获得良好控制,寻求新的、有效的治疗方法是目前哮喘研究的重点。哮喘发病机制复杂,气道炎症是哮喘发病的核心环节,也是导致气流阻塞和气道高反应性的主要原因。1型辅助性T细胞(Thl)/2型辅助性T细胞(Th2)失衡在哮喘发病机制中受到重视。当Th1功能抑制而Th2功能增强时,可通过Th2相关细胞因子诱导气道炎症,诱发哮喘。Th2相关细胞因子白细胞介素4(IL-4)可促使B细胞产生IgE,抑制嗜酸粒细胞凋亡并促使其在肺组织浸润,哮喘患者肺泡灌洗液和气道活检标本中IL-4水平显著升高。Thl相关细胞因子IFN-γ可抑制特异性IgE的生成。但是,Thl/Th2失衡不能解释哮喘所有发病机制,还存在其他免疫学机制参与调节哮喘气道炎症的形成,调节性T细胞(Treg)的重要性已得到证实。Treg通过多种机制诱导和维持机体对外来抗原和自身抗原(包括过敏原)产生免疫耐受,研究发现其对于控制哮喘炎症必不可少,尤其是CD4+CD25+Foxp3+Treg在哮喘的发病中发挥重要作用。CD4+CD25+Foxp3+Treg是CD4+T淋巴细胞的一个亚群,它通过分泌抑制性细胞因子(IL-10、TGF-β和IL-35)或细胞间的直接接触抑制对过敏原的免疫应答,从而促使机体产生免疫耐受。Treg细胞表面标志为CD4+和CD25+。Foxp3是一种特殊转录因子,在Treg细胞表面特异性表达,可反映Treg细胞的功能活性,也可作为Treg细胞鉴定的标志物。在CD4+CD25+Foxp3+Treg缺陷小鼠中过敏原诱导的气道高反应性显著增加；中重度哮喘患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg数量较轻度哮喘和正常对照组显著下降；CD4+CD25+Foxp3+Treg可减少气道粘液分泌,抑制气道平滑肌增生和胶原合成。因此,CD4+CD25+Foxp3+Treg对于控制哮喘气道炎症具有重要作用,它的数量减少或功能下降是哮喘发病的重要原因。髓源抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)是一群具有免疫抑制功能的异质性细胞,主要由不成熟的巨噬细胞、粒细胞、树突状细胞等髓系细胞组成。MDSCs对T淋巴细胞具有抑制功能,可通过抗原特异性和非特异性两种方式发挥免疫抑制作用。因其可进行体内诱导、体外扩增、自体和异体移植而成为目前免疫治疗研究热点。研究显示通过过继转移方式将MDSCs应用于哮喘、皮肤移植、炎症性肠病、Ⅰ型糖尿病和慢性湿疹等免疫性疾病中,具有良好的治疗效果。小鼠中MDSCs标记性分子是CDllb和Gr-1,Gr-1抗原又可进一步分为Ly6C和Ly6G抗原。据此,可将小鼠MDSCs分为CD11b+Ly6C+Ly6GCD11b+Ly6C-Ly6G+、CD11b+Ly6C+Ly6G+和CD11b+Ly6C-Ly6G-四种表型。不同表型MDSCs在生物学形态、代谢产物、扩增效应、体内分布部位、分泌的细胞因子及其对免疫炎症反应的影响均不相同,它们在炎症、肿瘤、感染及自身免疫性疾病中发挥的作用巨大且各不相同。MDSCs可诱导Treg增殖,促进Treg产生IL-10、TGF-β、INF-γ,抑制T细胞免疫。MDSCs在IFN-γ和IL-10的刺激下分泌大量干细胞生长因子(SCF),通过SCF诱导Treg增殖,阻断MDSCs中的SCF信号可抑制Treg增殖。MDSCs发挥免疫抑制作用与细胞外微环境中的精氨酸酶1(ARG1)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)分泌有关。MDSCs中富含ARG1和iNOS, ARG1分解精氨酸产生鸟氨酸和尿素,通过消耗精氨酸,造成精氨酸饥饿状态,导致CD3-ζ链合成下降,IL-2和IFN-γ合成减少,T细胞受体表达受阻,T淋巴细胞增殖抑制。MDSCs分泌的ARG1和iNOS可诱导T淋巴细胞凋亡。iNOS诱导大量一氧化氮(NO)合成释放,NO进而抑制T细胞增殖,降低IL-2、IFN-γ和IL-13的水平,通过抑制T细胞表达主要组织相容性复合体-Ⅱ(MHC-Ⅱ),使T细胞功能抑制。因此,ARG1和iNOS在MDSCs抑制T淋巴细胞活化过程中发挥重要作用。MDSCs增殖涉及多种细胞因子,信号转导与转录激活因子3(STAT3)是促进MDSCs增殖的主要转录因子。STAT3激活可引起MDSCs扩增明显增加,阻止STAT3的表达则会抑制MDSCs的增殖。STAT3通过诱导S100A8、S100A9蛋白高表达,与MDSCs细胞上的受体结合后,抑制DC细胞的分化,促进MDSCs增殖。采用STAT3基因敲除小鼠或使用STAT3抑制剂,可引起MDSCs增殖显著下降,因此STAT3可作为MDSCs增殖水平的观察指标。近年来,核转录因子-Kβ(NF-κB)在MDSCs功能中的关键作用逐渐被认识,NF-κB是MDSCs活化的重要细胞因子,TLRs通过激活MyD88,激活NF-κB,促进MDSCs中的ARGl和iNOS表达上调,促使MDSCs发挥对免疫功能的抑制作用。阻断NF-κB可抑制MDSC的活化,因此NF-κB可作为MDSCs活化的监测指标。目前,不同表型MDSCs对哮喘气道炎症的影响、对Th1/Th2、 CD4+CD25+Foxp3+Treg的作用及不同表型MDSCs与ARG1、iNOS、STAT3和NF-Kβ之间存在何种调控作用的研究国内外尚未见报道。我们前期实验研究已经证实LPS可以诱导大量MDSCs在小鼠脾脏中募集,给哮喘小鼠过继转移此MDSCs,能上调哮喘小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg比例,降低血清和BALF中IL-13水平,抑制哮喘小鼠的气道炎症。但是,实验尚未进一步研究是何种表型MDSCs亚群发挥抗炎治疗作用?不同表型MDSCs的免疫调节机制如何?不同表型MDSCs对哮喘气道炎症的影响、对Th1/Th2、CD4+CD25+Foxp3+Treg的调节作用有何不同?本研究利用LPS诱导MDSCs在小鼠脾脏募集,分离提纯不同表型MDSCs细胞,过继转移给经OVA致敏诱发的哮喘小鼠,观察Ly6C+Ly6G+、Ly6C-Ly6G+、Ly6C+Ly6G-和Ly6C-Ly6G-四种表型MDSCs对哮喘小鼠气道炎症的影响及对Thl/Th2、CD4+CD25+Foxp3+Treg的调节作用,并观察四种表型MDSCs与ARG1、iNOS、STAT3和NF-Kβ之间的作用,以揭示MDSCs调节气道炎症的免疫机制,探讨哮喘免疫调节治疗的新途径。第一部分不同剂量脂多糖对髓源抑制性细胞的诱导目的：探讨诱导小鼠合成MDSCs的脂多糖剂量和分选器官。方法：SPF级BALB/c雌性小鼠24只,随机分为lng脂多糖组、100ng脂多糖组、10μg脂多糖组和正常对照组,分别予以不同剂量脂多糖或生理盐水腹腔注射以诱导MDSCs募集；流式细胞仪观察脾脏和骨髓中MDSCs数量和Ly6C+Ly6G+、Ly6C-Ly6G+、Ly6C+Ly6G-和Ly6C-Ly6G-四种表型MDSCs比例。结果：1.流式细胞仪检测脾脏四种表型MDSCs比例：正常对照组Ly6C+Ly6G+、 Ly6C-Ly6G+、Ly6C+Ly6G-和Ly6C-Ly6G-、CDllb+MDSCs比例分别为60.97±3.15.3.31±0.63、15.30±3.13、22.87±1.69、3.30±0.57;1ng脂多糖组五种MDSCs比例分别为53.55±5.23、5.76±0.66、26.17±1.38、21.52±1.38、9.03±1.19：100ng脂多糖组五种MDSCs匕例分别为55.39±4.87、9.81±1.03、26.95±3.04、20.64±1.22、11.96±0.67;10μg多糖组五种MDSCs(?)匕例分别为70.58±4.20、2.96±0.27、11.63±1.19、16.56±3.06、7.47±1.46。与正常对照组比较,1ng脂多糖组、100ng脂多糖组和l0μg脂多糖组CD11b+MDSCs细胞显著增多(P=0.000,P=0.0000,P=0.000)。100ng脂多糖组CD11b+MDSCs细胞较lng脂多糖组和l0μg脂多糖组显著增多(P=0.000,P=0.000)。2.流式细胞仪检测骨髓四种表型MDSCs比例：正常对照组Ly6C+Ly6G+、 Ly6C-Ly6G+、Ly6C+Ly6G-和Ly6C-Ly6G-、CD11b+MDSCs比例分别为96.43±0.55、0.26±0.04、1.52±0.04、1.45±0.22、43.84±2.73;1ng脂多糖组五种MDSCs比例分别为96.45±0.85、0.71±0.53、1.00±0.19、1.67±0.48、55.35±2.99;100ng脂多糖组五种MDSCs比例分别为97.01±0.21、0.53±0.07、1.41±0.04、1.01±0.14、58.33±2.84；10μg多糖组五种MDSCs比例分别为93.31±2.40、0.76±0.04、1.51±0.11、4.63±2.08、48.31±1.04。与正常对照组比较,1ng脂多糖组、100ng脂多糖组和l0gg脂多糖组CD11b+MDSCs细胞显著增多(P=0.000,P=0.000,P=0.006)。100ng脂多糖组CD11b+MDSCs细胞较10μg脂多糖组增多(P=0.000)。3.骨髓中MDSCs细胞以Ly6C+Ly6G+细胞为主,脾脏中Ly6C+Ly6G-、 Ly6C-Ly6G+和Ly6C-Ly6G-细胞比例较骨髓增多。结论：1.脂多糖腹腔注射可以诱导大量MDSCs在正常小鼠脾脏和骨髓募集。2.100ng脂多糖是诱导小鼠MDSCs的较佳剂量,脾脏是分选不同表型MDSCs的较佳器官。第二部分不同表型髓源抑制性细胞体外对Th1/Th2、CD4+CD25+Foxp3+T调节性细胞的影响目的：观察不同表型MDSCs在体外和淋巴细胞共培养时对Th1/Th2、 CD4+CD25+Foxp3+Treg的影响。方法：SPF级BALB/c雌性小鼠24只,随机分为脂多糖组和细胞培养组,100ng脂多糖腹腔注射诱导MDSCs在小鼠脾脏中募集,流式细胞仪分选各表型MDSCs,获得纯化的四种表型MDSCs细胞：Ly6C+Ly6G+、Ly6C-Ly6G+、 Ly6C+Ly6G-和Ly6C-Ly6G-细胞。将四种表型MDSCs细胞在体外分别与小鼠淋巴细胞共培养,流式细胞仪检测各组Th1/Th2和CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例。结果：1.不同表型MDSCs细胞体外对Thl/Th2影响：Ly6C+Ly6G+组Thl/Th2较正常对照组增加(P=0.001)；Ly6C-Ly6G+、Ly6C+Ly6G-、|Ly6C-Ly6G-CD11b+MDSCs组Th1/Th2和正常对照组比较,差异无统计学意义(P=0.975,P=1.000,P=1.000,P=0.976)。2.不同表型MDSCs细胞体外对CD4+CD25+Foxp3+Treg影响：Ly6C+Ly6G+、Ly6C-Ly6G+、Ly6C+Ly6G-、Ly6C-Ly6G-、CD11b+MDSCs组CD4+CD25+Foxp3+Treg数量较正常对照组增加(P=0.000,P=0.000,P=0.001,P=0.000,P=0.003)。与Ly6C+Ly6G+组比较,Ly6C-Ly6G+、Ly6C+Ly6G-、Ly6C-Ly6G-、CD11b+MDSCs组CD4+CD25+Foxp3+Treg数量减少有统计学意义(P=0.007,P=0.000,P=0.000,P=0.000)。结论：1.Ly6C+Ly6G+细胞在体外可上调Th1/Th2,Ly6C-LyG+、Ly6C+Ly6G-、Ly6C-Ly6G-、CD11b+MDSCs细胞在体外对Th1/Th2无影响。2.四种表型MDSCs细胞在体外均可诱导CD4+CD25+Foxp3+Treg增殖,使其数量增加,以Ly6C+Ly6G+细胞作用最为显著。第三部分不同表型髓源抑制性细胞体内对哮喘小鼠气道炎症及Th1/Th2、 CD4+CD25+Foxp3+T调节性细胞的影响目的：观察不同表型MDSCs过继转移给哮喘小鼠,在体内对气道炎症、Th1/Th2、CD4+CD25+Foxp3+Treg的影响。方法：SPF级BALB/c雌性小鼠52只,10只接受脂多糖腹腔注射,用于制备髓源抑制性细胞,方法同第一部分；另外42只小鼠随机分为7组：正常对照组、哮喘组、Ly6C+Ly6G+细胞治疗组、Ly6C-Ly6G+细胞治疗组、Ly6C+Ly6G-细胞治疗组、Ly6C-Ly6G-细胞治疗组和CD11b+MDSCs细胞治疗组。应用鸡卵清蛋白致敏后雾化激发方法建立BALB/c小鼠哮喘模型,将不同表型MDSCs细胞经尾静脉注射过继转移给哮喘小鼠。收集各组小鼠外周血、肺泡灌洗液(BALF)、肺组织标本,应用小鼠无创肺功能仪检测肺功能,光镜下观察肺组织病理学改变,观察BALF中细胞总数并分类计数,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测BALF和外周血中IL-4含量,流式细胞仪检测外周血Th1/Th2、 CD4+CD25+Foxp3+Treg比例。结果：1.哮喘模型制备成功的判定：根据小鼠的症状表现、肺功能、BALF细胞分类计数、肺组织病理学,提示哮喘小鼠模型制备成功。2.肺功能检测结果：乙酰甲胆碱浓度为6.25mg/ml、12.5mg/ml、25mg/ml和50mg/ml时,哮喘组增强呼气间歇值(Penh)较正常对照组升高(P=0.000,P=0.000, P=0.000, P=0.000); Ly6C+Ly6G+组、Ly6C-Ly6G+组、CD11b+MDSCs组Penh较哮喘组下降(P<0.05); Ly6C+Ly6G组、Ly6C-Ly6G-组Penh和哮喘组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3. BALF细胞计数结果：哮喘组BALF细胞总数、嗜酸粒细胞和中性粒细胞比例较正常对照组增加(P=0.000,P=0.000,P=0.000)；与哮喘组比较,Ly6C+Ly6G+组、Ly6C-Ly6G+组、CD11b+MDSCs组细胞总数比例下降(P=0.004,P=0.006,P=0.009),嗜酸粒细胞比例下降(P=0.000,P=0.000,P=0.000),中性粒细胞比例下降(P=0.000,P=0.000,P=0.000)；与哮喘组比较,Ly6C+Ly6G-组、Ly6C-Ly6G-组细胞总数、嗜酸粒细胞数、中性粒细胞数差异无统计学意义(P>0.05)；七组小鼠淋巴细胞比例比较,差异无统计学意义(P>0.05)。4.肺组织病理学改变：正常对照组小鼠肺组织结构完整,肺泡腔内无渗出物,无明显炎症细胞浸润。哮喘组小鼠支气管粘膜充血水肿,细支气管和血管周围有大量炎症细胞浸润,肺泡腔内渗出物增多,气道杯状细胞肥大增生；与哮喘组相比,Ly6C+Ly6G+组、Ly6C-Ly6G+组、CD11b+MDSCs组支气管及血管周围炎性细胞浸润减少,炎症减轻。Ly6C+Ly6G-组、Ly6C-Ly6G-组和哮喘组病理变化相似,无明显改善。5.血清和BALF中IL-4含量：哮喘组血清和BALF中IL-4含量较正常对照组增加(P=0.000,P=0.000)；与哮喘组比较,Ly6C+Ly6G+组、Ly6C-Ly6G+组、CDllb+MDSCs组血清IL-4含量减少(P=0.000,P=0.000, P=0.000)、BALF中IL-4含量减少(P=0.000,P=0.000,P=0.000)；与哮喘组比较,Ly6C+Ly6G-组、Ly6C-Ly6G-组血清和BALF中IL-4含量差异无统计学意义(P>0.05)。6.小鼠外周血Th1/Th2流式分析：哮喘组Th1/Th2较正常对照组减小(P=0.001)；与哮喘组比较,Ly6C+Ly6G+组、Ly6C-Ly6G+组、Ly6C+Ly6G-组、Ly6C-Ly6G-组、CD11b+MDSCs组Thl/Th2增大(P=0.002,P=0.004,P=0.001,P=0.001,P=0.019)。7.小鼠外周血Treg细胞流式分析：哮喘组CD4+CD25+Foxp3+Treg比例较正常对照组下降(P=0.000)；与哮喘组比较,Ly6C+Ly6G+组、Ly6C-Ly6G+组、Ly6C+Ly6G-组、Ly6C+Ly6G-组、CD11b+MDSCs组CD4+CD25+Foxp3+Treg比例增加,差异有统计学意义(P=0.002,P=0.012, P=0.026, P=0.000, P=0.001)。结论：1.将不同表型MDSCs细胞过继转移给哮喘小鼠,Ly6C+Ly6G+. Ly6C-Ly6G+、CD11b+MDSCs细胞对哮喘气道炎症具有抑制作用：①可降低哮喘小鼠气道反应性；②减少BALF中嗜酸粒细胞和中性粒细胞数量；③降低血清和BALF中IL-4含量；④减轻气道炎症,改善哮喘小鼠肺组织病理。2. Ly6C+Ly6G-、Ly6C-Ly6G-MDSCs细胞对哮喘小鼠气道炎症、气道反应性、BALF中炎症细胞数量、肺组织病理、血清和BALF中IL-4含量无显著影响。3. Ly6C+Ly6G+、Ly6C-Ly6G+、CD11b+MDSCs细胞可增加外周血Thl/Th2,上调CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例,这可能是其治疗哮喘、发挥免疫抑制作用的重要途径。第四部分不同表型髓源抑制性细胞影响哮喘小鼠气道炎症免疫调节机制探讨目的：探讨不同表型MDSCs影响哮喘小鼠气道炎症的免疫调节机制。方法：所用小鼠即为第三部分实验小鼠,ELISA检测各组小鼠BALF中NO含量,提取不同表型MDSCs细胞的RNA,实时荧光定量核酸扩增检测系统(QPCR)检测其ARG1和iNOS含量,免疫组织化学技术(IHC)检测小鼠肺组织ARG1、iNOS、stat3、NF-κB含量。结果：1.BALF中NO含量：哮喘组BALF中NO含量(8.19±1.92)较正常对照组(0.55±0.07)增加(P=0.002); Ly6C+Ly6G+、Ly6C+Ly6G+、Ly6C+Ly6G+、 Ly6C-Ly6G-、CD11b+MDSCs组NO含量为0。2. QPCR检测不同表型MDSCs中ARGl和iNOS含量：ARG1含量从高至低依次为Ly6C-Ly6G+、CD11b+MDSCs、Ly6C+Ly6G+、Ly6C+Ly6G-、Ly6C-Ly6G-组;iNOS含量：Ly6C+Ly6G+组最高,其次为Ly6C+Ly6G-组,Ly6C-Ly6G+、 Ly6C-Ly6G-和CD11b+MDSCs组iNOS含量均为0。3.IHC检测肺组织ARG1表达：哮喘组可见大量ARG1表达,正常对照组未见ARG1表达。ARG1表达从高至低依次为Ly6C-Ly6G+、CD11b+MDSCs、 Ly6C+Ly6G+、Ly6C+Ly6G-组,Ly6C-Ly6G-组未见ARG1表达。4.IHC检测肺组织iNOS表达：哮喘组可见大量iNOS表达,正常对照组未见iNOS表达。各表型MDSCs均未见iNOS表达。5.IHC检测肺组织STAT3表达：哮喘组、正常对照组、各表型MDSCs均未见STAT3表达。6.IHC检测肺组织NF-κB表达：哮喘组可见大量NF-κB表达,正常对照组未见NF-κB表达。各表型MDSCs均可见NF-κB表达,NF-κB表达从高至低依次为Ly6C-Ly6G+、Ly6C+Ly6G+、CDllb+MDSCs、Ly6C+Ly6G+、Ly6C-Ly6G+组。结论：1.不同表型MDSCs细胞发挥免疫抑制作用与ARG1分泌有关,Ly6CLy6G+细胞分泌ARG1最为显著。2.四种表型MDSCs过继转移给哮喘小鼠后,在体内通过NF-κB活化,Ly6C+Ly6G+细胞活化作用最为显著,但未通过STAT3途径增殖。