目的细胞分裂周期蛋白14B(cell division cycle 14B,Cdc14B)属于丝氨酸/苏氨酸双特异性磷酸酶家族,在细胞周期调控、生长发育、信号转导等方面发挥重要作用。有研究表明,人类Cdc14B在有丝分裂间期定位于核仁中,其生物学功能主要包括调节有丝分裂退出、核组装、有丝分裂纺锤体组装、中心粒复制、激活G2期DNA损伤检查点。对小鼠卵母细胞的研究表明,过表达Cdc14B可延迟卵母细胞减数分裂的恢复,下调Cdc14B表达可引起减数分裂提前恢复。对哺乳动物细胞的研究表明,少量Cdc14B定位于有丝分裂中心体,与polo样激酶Plk1共同维持细胞核结构。对U2OS细胞系的研究认为Cdc14B具有捆绑、稳定微管的功能,它在间期定位于细胞核,在后期聚集到纺锤体中央区,Cdc14B通过其亚细胞定位调节纺锤体及微管的功能,从而调节细胞的有丝分裂进程。我们前期的研究已证实小鼠一细胞期受精卵各期均有Cdc14B的表达,在小鼠一细胞期受精卵中,Cdc14B和β-tubulin在G1期、S期共定位于小鼠受精卵皮质,在早G2期,Cdc14B和β-tubulin共定位于细胞质,在晚G2期,部分Cdc14B入核,在M期,Cdc14B和β-tubulin共定位到纺锤体。综合上述资料,暗示Cdc14B在小鼠一细胞期受精卵有丝分裂及调节纺锤体功能中可能发挥重要作用。本研究以小鼠一细胞期受精卵作为研究对象,通过显微注射Cdc14B m RNA观察小鼠一细胞期受精卵的卵裂率、死亡率及G2/M转变的影响;通过显微注射Cdc14B-MO观察小鼠一细胞期受精卵的卵裂率、死亡率、细胞形态以及纺锤体变化;通过显微注射荧光质粒p CMV3-GFPSpark-Cdc14B观察在小鼠一细胞期受精卵中Cdc14B的亚细胞定位。这为进一步研究Cdc14B在小鼠一细胞期受精卵发育过程中的分子调控机制提供理论依据。方法:1.采集小鼠受精卵需要进行超排卵,分别收集四个时期的小鼠一细胞期受精卵;2.同源重组法构建荧光表达质粒p CMV3-GFPSpark-Cdc14B;3.将构建的荧光表达质粒p CMV3-GFPSpark-Cdc14B经体外转录为m RNA,后续用于显微注射;4.显微注射Cdc14B m RNA,观察对小鼠一细胞期受精卵发育的影响;5.显微注射Cdc14B的反义寡核苷酸(MO)沉默Cdc14B基因,并观察其对受精卵发育的影响;6.RT-PCR、Western blotting验证显微注射Cdc14B-MO后干涉效能;7.通过间接免疫荧光观察沉默Cdc14B基因后其与β-tubulin亚细胞共定位情况;8.荧光质粒p CMV3-GFPSpark-Cdc14B的细胞核注射,观察目的蛋白的亚细胞定位;结果:1.Cdc14B m RNA注射组,在h CG注射后32-32.5h开始出现卵裂,h CG注射后33h,受精卵的卵裂率是45.7%;未注射组和TE缓冲液注射组均为对照组,这两组开始卵裂时间为h CG注射后28.5h-29h;在h CG注射后31h,未注射组卵裂率为63%、TE缓冲液注射组卵裂率为61.7%;在h CG注射后33h,未注射组卵裂率为94.7%、TE缓冲液注射组卵裂率为93.6%。2.RT-PCR结果显示:Cdc14B基因在各组小鼠一细胞期受精卵均有表达,Cdc14B m RNA注射组表达量明显高于对照组,Western blotting结果可见注射Cdc14B m RNA后12h m RNA已经翻译成蛋白质,在Cdc14B m RNA注射组Cdc14B蛋白高表达。3.Cdc14B-MO注射组,受精卵在h CG注射后27-27.5h开始卵裂,受精卵在h CG注射后31h,卵裂率是85.9%;h CG注射后33h,受精卵的卵裂率是97.8%。4.RT-PCR结果显示:Cdc14B基因在各组小鼠一细胞期受精卵均有表达,Cdc14B-MO注射组表达量明显低于对照组,Western blotting检测Cdc14B-MO注射组Cdc14B蛋白的表达,与对照组相比大约降低80%左右,说明Cdc14B-MO干涉效果较好。5.间接免疫荧光实验显示,沉默Cdc14B基因后,其荧光信号明显减弱。Cdc14B-MO注射组在受精卵M期β-tubulin参与构建的纺锤体崩塌,没有明显的双极形成。6.显微注射p CMV3-GFPSpark-Cdc14B后,分裂期中期荧光信号集中于纺锤体,说明Cdc14B在分裂期中期定位于纺锤体;在分裂期后期,Cdc14B定位于纺锤体和细胞皮质。结论:1.过表达Cdc14B蛋白,小鼠一细胞期受精卵延迟进入M期;2.沉默Cdc14B基因能使小鼠一细胞期受精卵卵裂时间提前,加速G2/M期转换;3.沉默Cdc14B基因会导致小鼠一细胞期受精卵纺锤体形状异常。4.Cdc14B在有丝分裂分裂期定位于纺锤体可能与调控纺锤体组装、调节有丝分裂的进程有关。