【摘 要】
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目的:Zeste基因增强子同源物2（enhance of zeste homolog 2,EZH2）为表观遗传抑制因子Pc G家族（poly-comb group）的重要成员之一,可以对核小体组蛋白H3K27进行甲基化修饰。基因的甲基化可使某些基因失活或转录抑制,而去甲基化可诱导基因活化或再表达,因此甲基化水平可以影响下游抑癌基因的沉默、癌基因的过表达以及加重DNA修复机制中的缺陷,从而最终导致肿
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目的:Zeste基因增强子同源物2（enhance of zeste homolog 2,EZH2）为表观遗传抑制因子Pc G家族（poly-comb group）的重要成员之一,可以对核小体组蛋白H3K27进行甲基化修饰。基因的甲基化可使某些基因失活或转录抑制,而去甲基化可诱导基因活化或再表达,因此甲基化水平可以影响下游抑癌基因的沉默、癌基因的过表达以及加重DNA修复机制中的缺陷,从而最终导致肿瘤发生,并在癌细胞的增殖、分化及抑制其凋亡的过程中起着关键作用。本实验拟选用HPV16阳性宫颈癌SiHa细胞系,构建EZH2低表达细胞模型,探究EZH2对SiHa细胞生物学特性的影响,以进一步在分子生物学层面的认识宫颈癌,为探索宫颈癌恶性生物学特性的潜在分子机制、相关治疗靶点及预测预后提供思路。方法:本实验将EZH2 siRNA及阴性对照siRNA转染至SiHa细胞,通过qRTPCR检测EZH2的转染率,通过Western Blotting确定细胞EZH2蛋白功能水平,构建EZH2敲低组及对照组,使用EDU实验检测敲低EZH2后细胞增殖能力;通过划痕实验检验敲低EZH2后,SiHa细胞迁移能力的改变;Transwell实验检测敲低EZH2对SiHa细胞侵袭能力的影响;流式细胞仪检测低表达EZH2对细胞凋亡的影响。所有统计分析通过SPSS 23.0和Graphpad Prism 8.0软件进行,计量资料以均数±标准差（±s）表示,两组间比较采用独立样本t检验分析,所有实验至少重复三次,P＜0.05表示差异有统计学意义。结果:1.首先用siRNA转染SiHa细胞,通过qRT-PCR确定转染效率最佳的siRNA,构建了EZH2低表达细胞模型,qRT-PCR检测EZH2的m RNA水平结果表示:si-EZH2组的m RNA的表达量（0.29±0.02）,与si-NC组（1.02±0.11）相比,表达水平显著降低（P＜0.001）;2.通过Western Blotting检验EZH2的蛋白水平,si-EZH2组的EZH2蛋白表达量（0.39±0.06）,与si-NC组（1.02±0.03）相比,表达水平显著降低（P＜0.001）,验证了EZH2蛋白表达受到抑制,随后进行了细胞功能缺失实验;3.EDU实验检测各组细胞增殖率（%）:相对于siNC组（35.72±2.61）,si-EZH2组（16.65±1.16）的细胞增殖能力显著降低（P＜0.001）,敲低EZH2表达能够有效抑制宫颈癌细胞的DNA合成,细胞增殖活性减弱;4.划痕实验检测各组细胞迁移率（%）:在第12h,si-EZH2组（16.59±1.41）与si-NC组（30.50±0.27）相比,细胞迁移能力显著降低（P＜0.001）;在第24h,si-EZH2组（23.24±0.72）与si-NC组（35.61±1.98）相比,细胞迁移能力降低（P＜0.01）;在第48h,si-EZH2组（34.26±2.24）与si-NC组（47.54±0.38）相比,细胞迁移能力降低（P＜0.01）,敲低EZH2后细胞迁移能力明显减弱;5.Transwell实验检测低表达EZH2对SiHa细胞侵袭能力的影响:与si-NC组（1119.00±48.09）相比,si-EZH2组（742.33±109.39）的侵袭细胞数降低（P＜0.05）,EZH2敲低后宫颈癌细胞向下侵袭的数量明显减少,敲低EZH2能够有效抑制细胞的远处转移;6.通过流式细胞仪分析细胞凋亡占比（%）:相对于si-NC组（2.79±0.11）,si-EZH2组（4.39±0.17）的细胞凋亡率显著增高（P＜0.001）,敲低EZH2能显著增加细胞凋亡比例。结论:本研究通过siRNA转染HPV16阳性宫颈癌细胞,改变了细胞EZH2的表达水平,从而展开了一系列关于EZH2的细胞功能缺失实验。初步研究发现EZH2对SiHa细胞的增殖、迁移和侵袭等方面均存在促进恶性作用,且抑制细胞凋亡。因此,我们认为EZH2可以促进宫颈癌的发生、进展及转移,为宫颈癌患者的治疗提供了潜在的靶点。
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