论文部分内容阅读
目的探究沉默人THP-1源性巨噬细胞中YKL-40基因对其炎症因子的表达及促血管形成能力的影响;将沉默后的THP-1细胞与子宫内膜癌HEC-1A细胞共培养,探讨YKL-40是否可通过炎症细胞的改变进而影响子宫内膜癌细胞的迁移和侵袭能力。沉默HEC-1A细胞中YKL-40基因后探究YKL-40作为炎症标志物是否影响HEC-1A炎症因子的表达;并通过体内动物实验探讨YKL-40在裸鼠体内对巨噬细胞的募集及子宫内膜癌生长的影响。方法1、应用si RNA干扰技术合成靶向沉默YKL-40基因的序列,构建YKL-40-si RNA慢病毒载体对THP-1细胞和HEC-1A细胞进行转染。2、将两种细胞株分别分为三组:空白对照组（Blank control group）:未经慢病毒转染的细胞;空载体组（Negative control group）:只转染空病毒载体的细胞;实验组（YKL-40-si RNA group）:转染带有YKL-40si RNA干扰片段的慢病毒的细胞。运用嘌呤霉素实验对上述转染后细胞进行筛选,并通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达确定转染效率。3、运用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（q RT-PCR）方法检测沉默YKL-40基因前后各组THP-1细胞和HEC-1A细胞中YKL-40、IL-8和MMP-9等炎症因子的表达情况。4、用佛波酯（PMA）刺激各组人THP-1源性巨噬细胞使之分化成为M2型贴壁巨噬细胞后提取培养液上清。5、运用人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）体外血管形成实验检测沉默YKL-40对巨噬细胞促血管形成能力的影响。6、将未处理的HEC-1A细胞与各组巨噬细胞培养液上清共培养,运用transwell实验检测经过YKL-40基因沉默的巨噬细胞对子宫内膜癌细胞迁移和侵袭能力的影响。7、用HEC-1A细胞构建子宫内膜癌裸鼠移植瘤模型,绘制移植瘤生长曲线。8、切除各组子宫内膜癌裸鼠移植瘤,用免疫组化法和蛋白印迹实验（western blotting）检测沉默YKL-40基因前后移植瘤组织中YKL-40和巨噬细胞表面标志物CD68的表达水平。结果1、成功转染并筛选出了稳定沉默YKL-40基因的THP-1细胞和HEC-1A细胞,转染效率超过80%,细胞传代培养后转染效率无明显变化。2、运用q RT-PCR检测转染后各组THP-1细胞中YKL-40、MMP-9、IL-8的m RNA相对表达水平:YKL-40-si RNA实验组、空载体组、空白对照组中YKL-40 m RNA相对表达水平分别为:0.10±0.03、1.27±0.20、1.02±0.06;MMP-9 m RNA相对表达水平分别为:0.34±0.09、1.05±0.12、0.89±0.09:IL-8 m RNA相对表达水平分别为:0.29±0.05、1.07±0.18、1.08±0.05。YKL-40-si RNA实验组中各炎症因子表达水平均明显低于空载体组和空白对照组（P0.05）。3、成功用佛波酯（PMA）诱导各组人THP-1源性巨噬细胞分化成为M2型贴壁巨噬细胞。4、显微镜下观察体外成管实验结果:YKL-40-si RNA实验组形成的小管数量较少,结构欠佳;空白对照组和空载体组形成的小管数量较多,结构完整。经统计学分析,YKL-40-si RNA实验组的成管数目为（15.22±1.71）明显少于空白对照组（61.94±7.69）和空载体组（56.41±4.81）,差异有统计学意义（F=114.728,P=0.000）。5、将巨噬细胞培养液上清与HEC-1A细胞共培养后transwell迁移实验结果显示:YKL-40-si RNA实验组穿膜细胞为（187±19）个,明显少于空载体组和空白对照组[分别为（350±13）和（336±15）个,P<0.05];而空载体组和空白对照组比较,差异无统计学意义（P=0.872）。Transwell侵袭实验结果示:YKL-40-si RNA实验组穿膜细胞为（178±6）个,明显少于空载体组和空白对照组[分别为（391±10）和（386±9）个,P<0.05];而空载体组和空白对照组比较,差异无统计学意义（P=0.383）。6、运用q RT-PCR检测转染后各组HEC-1A细胞中YKL-40、MMP-9、IL-8的m RNA相对表达水平:YKL-40 m RNA相对表达水平分别为:0.36±0.13、1.04±0.07、0.98±0.10;MMP-9 m RNA相对表达水平分别为:0.65±0.28、1.00±0.03、1.03±0.08;IL-8 m RNA相对表达水平分别为:0.40±0.36、1.02±0.06、0.96±0.16。YKL-40-si RNA实验组中各炎症因子的表达水平均明显低于空载体组和空白对照组（P0.05）。7、成功构建子宫内膜癌裸鼠移植瘤模型并绘制移植瘤生长曲线。YKL-40-si RNA实验组裸鼠移植瘤较其他两组生长更缓慢且体积更小,差异具有统计学意义（P<0.05）。8、免疫组化检测裸鼠移植瘤组织结果示:YKL-40在空白对照组、空载体组、实验组移植瘤组织中的阳性表达率分别为67.50±29.96%、77.50±14.75%、5.83±12.01%;巨噬细胞表面标志物CD68在空白对照组、空载体组、实验组移植瘤组织中的阳性表达率分别为55.00±18.71%、66.67±12.11%、3.33±8.17%。实验组YKL-40、CD68的阳性率明显低于空白对照组和空载体组,差异均有统计学意义（P0.05）。9、用Western blotting检测si RNA实验组、空载体组、空白对照组裸鼠移植瘤组织中YKL-40、CD68的表达结果示:YKL-40蛋白的相对表达水平分别为:0.68±0.01、0.87±0.08、0.93±0.08;CD68蛋白的相对表达水平分别为:0.58±0.18、0.94±0.01、0.94±0.01。实验组移植瘤组织中YKL-40、CD68蛋白的表达均低于其他两组,差异均有统计学意义（P0.05）。结论沉默人THP-1源性巨噬细胞中YKL-40基因可下调其炎症因子的表达并抑制巨噬细胞促血管形成能力。巨噬细胞作为炎症细胞,通过沉默其YKL-40基因可抑制子宫内膜癌细胞的迁移和侵袭。沉默HEC-1A细胞的YKL-40基因可下调子宫内膜癌细胞中炎症因子的表达,并能抑制子宫内膜癌裸鼠移植瘤的生长及移植瘤组织中巨噬细胞的募集和浸润。因此,YKL-40作为炎症标志物,可能能影响炎症及子宫内膜癌的发生发展,其将有望成为子宫内膜癌新的治疗靶点。