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研究目的临床及流行病学研究显示女性月经周期内结肠传输速度发生周期性波动,女性功能性便秘发生率明显高于男性,提示性激素在结肠运动调节中具有重要作用,但其机制尚不明确。本课题旨在研究新型雌激素膜受体—PER (G protein coupled estrogen receptor)在雌性C57BL/6小鼠结肠的表达及表达调控机制,探究GPER在生理条件下结肠运动功能调节中的作用及机制,并进一步观察17β雌二醇(E2)-GPER途径在慢性传输型便秘发生中的作用。研究揭示E2调节结肠运动的受体及受体后分子机制,为慢性传输型便秘新的治疗靶点的发现提供实验依据。研究方法及内容根据实验需要分别选择雌性或雄性成年C57BL/6小鼠。第一部分：RT-PCR, Western Blot免疫组化、免疫荧光三标等方法明确GPER在结肠的表达及细胞定位。Real-time PCR、Western Blot分别在mRNA及蛋白水平检测生理动情周期内雌性C57BL/6小鼠结肠肌间神经元GPER的表达变化。为进一步研究E2调节GPER表达的机制,分离培养雄性成年C57BL/6小鼠肌间神经元,在外源性E2处理神经元2小时、6小时、12小时及24小时后收集神经元,RT-PCR及Western Blot检测神经元GPER表达的改变；根据外源性E2调节GPER表达的时间反应曲线,选取合适的作用时间点,检测选择性雌激素膜受体阻断剂G15及核受体阻断剂ICI182.780对E2调节GPER表达的影响,明确E2调节GPER表达的受体机制。第二部分：利用玻璃珠推动实验在体检测雌性C57BL/6小鼠结肠传输能力,观察生理动情周期内结肠传输时间的波动及E2急性替代治疗对卵巢去势雌性C57BL/6小鼠结肠传输的影响,并进一步观察GPER在生理动情周期内和E2急性替代治疗后结肠传输变化中的作用。器官浴槽实验记录离体卵巢去势C57BL/6小鼠结肠环行肌运动,检测GPER选择性激活对卡巴胆碱诱导的结肠肌条收缩的影响；分别用TTX和选择性nNOS抑制剂NPLA预处理结肠肌条对GPER激活引起的结肠肌条收缩抑制的影响。免疫荧光、硝酸还原酶法及激光共聚焦显微镜检测E2或选择性GPER激动剂G1对肌间神经元一氧化氮(Nitric Oxide, NO)生成的影响及nNOS抑制剂预处理对GPER激活诱导NO生成的影响。免疫组织化学、Western Blot检测在体E2替代治疗和外源性E2预处理对结肠组织nNOS蛋白表达的影响以及GPER选择性阻断剂G15预处理对E2调节nNOS表达的影响。最后,以冷水灌胃方式制备慢性传输型便秘小鼠模型,观察E2-GPER途径在慢性传输型便秘结肠传输抑制中的作用。研究结果第一部分：1.小鼠结肠隐窝上皮细胞、粘膜下及肌间神经元均有GPER阳性表达。2.肌间神经元GPER表达在生理动情周期内发生波动,动情前期显著高于动情间期。3.外源性E2预处理肌间神经元,6小时后GPER mRNA和蛋白表达开始上调,12小时达到高峰。4.选择性阻断GPER不影响E2上调GPER表达的作用；相反,选择性雌激素核受体阻断剂预处理后,E2上调GPER表达的作用被阻断。第二部分：1.生理动情周期内结肠推动力发生周期性波动,与内源性雌激素水平负相关。选择性阻断GPER可以抑制内源性雌激素水平波动引起的结肠传输抑制。急性E2替代治疗延缓了卵巢去势小鼠结肠传输速度,选择性阻断GPER阻断了E2的作用。2.选择性GPER激动剂G1浓度依赖性的抑制卡巴胆碱诱导的结肠环行肌肌条收缩,TTX和选择性nNOS阻断剂NPLA预处理能阻断G1抑制结肠肌条收缩的作用。3.E2及选择性GPER激动剂G1均可刺激肌间神经元NO释放,nNOS阻断剂NPLA预处理阻断GPER激活诱导的肌间神经元NO生成。4.在结肠肌间神经丛,GPER表达于nNOS阳性肌间神经元。5.E2替代治疗上调卵巢去势小鼠结肠nNOS表达；外源性E2预处理结肠组织,肌间神经丛nNOS蛋白表达上调,以上作用均可以被选择性GPER阻断剂G15阻断。6.冷水灌胃28天后卵巢去势小鼠结肠传输时间明显延长,E2替代治疗加剧了结肠传输抑制,选择性阻断GPER能阻断E2在STC模型中的作用。结论结肠肌间神经元表达GPER,GPER表达水平受E2正调控。E2可能通过作用于雌激素核受体,上调GPER表达。E2作用于结肠肌间神经元GPER,抑制结肠运动,与生理动情周期内结肠传输时间的抑制有关；E2对结肠传输的抑制与激活GPER上调肌间神经元nNOS表达,诱导NO释放有关；GPER参与了E2诱导的STC结肠传输的抑制。