[研究目的]肺纤维化是一种难治性、具有高死亡率的肺间质性疾病,特征为肺泡壁(肺泡炎)受损,成纤维细胞/肌成纤维细胞异常聚集,胶原和其他细胞外基质的过度沉积,异常组织修复导致肺功能丧失。肺纤维化的发病原因及机制并不清楚,但肺纤维化引起不可逆性的肺功能障碍和呼吸衰竭,造成非常严重的致死性结果。临床试验证实,激素和非激素免疫抑制剂、抗纤维化、抗细胞因子及免疫调节等药物对治疗肺纤维化无明确疗效。肺移植是目前治疗终末期肺纤维化的唯一有效方法。肺纤维化发病机制的研究一直是国内外医学界研究热点和难点。以往对肺纤维化发病机制的研究主要集中在对调节分泌胶原蛋白的成纤维细胞的增殖、活化和分化方面。近年研究发现,多种致炎症介质(TNF、IL-1β、CXCL1、MIP-2. PDGF和TGF-β1等)、氧化应激和抑制炎症介质(PGE2、COX-2)在肺纤维化的形成中起着重要作用。在过去的几年,趋化因子、趋化因子受体和趋化因子受体信号及整合蛋白α3β1、WNT1诱导信号蛋白1(WISP-1)及PI3K-AKT-S6K1和Wnt-βcatenin信号通路已被作为目前抗肺纤维化治疗研究的干预作用靶点。T淋巴细胞在肺纤维化的形成中起到重要作用已被目前研究证实,目前主要集中在Th1/Th2细胞的失衡与调节性T淋巴细胞。新近研究发现,一群不同于Th1、Th2、Treg的细胞亚群,它们不表达IL-4或IFN-γ,却高水平分泌IL-17,被命名为Th17细胞。Th17细胞通过分泌IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-6、TNF-γ等细胞因子发挥效应功能,在自身免疫病、感染等疾病中发挥重要的作用已经被证实。Th17细胞及其分泌的IL-17A被认为与肺纤维化发生有关,但在肺纤维化的发病机制中的作用报道较少,具体的机制也并未阐述。综上所述,为了研究肺纤维化发病的机制,我们推测Th17细胞及IL-17在肺纤维化发病机制中可能起到重要作用。为了证明这一假说,本研究拟从以下几个方面进行研究：①Th17细胞分泌IL-17在博来霉素致肺纤维化中的作用；②Th17细胞分化在肺纤维化中的作用；③IL-17对体外肺成纤维细胞的增殖、转化和分泌作用；④IL-17对体外siRNA-Act1转染肺成纤维细胞和NF-κB通路的作用。研究阐明Th17细胞及IL-17在肺纤维化形成中的作用机制,可为肺纤维化治疗提供新的策略和干预作用的细胞和分子靶点。[研究方法]1.Th17细胞分泌IL-17在博来霉素致肺纤维化中的作用研究方法：①博来霉素致小鼠肺纤维化模型制备。随机分为2组正常组和博莱霉素组(n=20),采用直视下气管内注入博莱霉素(0.05ml,5mg/kg),正常组注入同体积的生理盐水,分别于3、7、14、28天处死；②HE染色和Masson染色评价肺组织病理形态学改变；③生物化学方法测定小鼠肺组织羟脯氨酸含量；④免疫组织化学方法测定肺组织IL-17A蛋白的表达和定位；⑤RT-PCR方法测定IL-17AmRNA的表达；⑥流式细胞技术测定脾淋巴细胞Thl7的表达。2.Th17细胞分化在肺纤维化中的作用研究方法：①博来霉素致小鼠肺纤维化模型制备。随机分为3组,正常组、博莱霉素组和全反式维甲酸组(n=5),采用直视下气管内注入博莱霉素(0.05ml,5mg/kg),正常组注入同体积的生理盐水,全反式维甲酸组第0天气管内注射博莱霉素5mg/kg,同时予腹腔注射全反式维甲酸0.5mg/只,每周三次。三组均于28天处死；②HE染色和Masson染色评价肺组织病理形态学改变；③生物化学方法测定小鼠肺组织羟脯氨酸含量；④RT-PCR方法和免疫组织化学方法测定肺组织IL-17AmRNA和蛋白的表达；⑤RT-PCR方法测定TGF-β、IL-10、IL-6mRNA的表达；⑤流式细胞技术测定脾淋巴细胞Th17和CD4+CD25+T细胞的表达。3.IL-17对体外肺成纤维细胞的增殖、转化和分泌作用研究方法：①博莱霉素诱导肺纤维化模型的建立,分别于3、7、14、28天处死。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测IL-17ARmRNA在肺纤维化形成中表达的变化,选择表达IL-17ARmRNA最佳时间的肺成纤维细胞进行原代培养和激光共聚焦显微镜下观察波型蛋白鉴定。②IL-17与肺成纤维细胞共培养分别观察24h、48h和72h,使用四氮唑蓝比色法(MTT)检测不同浓度的IL-17对肺成纤维细胞的增殖,明确最佳刺激浓度。③免疫荧光、RT-PCR和Western Blotting检测肌成纤维细胞标志物a-SMA。④RT-PCR和Western Blotting检测IL-17对肺成纤维细胞Ⅰ和Ⅲ型胶原的表达。4.IL-17对体外siRNA-Actl转染肺成纤维细胞和NF-KB通路作用的研究方法：①阳离子脂质体法转染siRNA-Act1进入肺成纤维细胞,确定转染的最佳浓度和干扰时间；②荧光定量PCR和western blotting方法鉴定Act1干扰效率；③实验分成3组,空白组(.IL-17-siRNA-Act1),对照组(+IL-17-siRNA-Act1),干扰组(+IL-17+siRNA-Act1)。四氮唑蓝比色法比较IL-17对肺成纤维细胞和siRNA-Actl转染肺成纤维细胞的增殖效果；③免疫荧光和Western Blotting检测肌成纤维细胞标志物a-SMA；④Western Blotting检测肺成纤维细胞Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白的表达；⑤IL-17与肺成纤维细胞和siRNA-Act1转染肺成纤维细胞共培养,分别于0min,15min,30min和60min荧光定量PCR检测P65、IκB和Act1mRNA的表达,western blotting方法检测P65、p-P65、IKB、p-IκB和Act1蛋白表达[研究结果]1.Th17细胞分泌IL-17A在博来霉素致肺纤维化中的作用结果：①成功构建博来霉素诱导肺纤维化模型,HE染色示肺泡炎在14d达高峰,Masson染色及羟脯氨酸测定反应肺纤维化均在28d最明显。②IL-17A定位在终末支气管、呼吸性细支气管和肺泡上皮。③IL-17A在第7d表达开始增加,14d达到高峰,28d有所下降,但均高于正常组。④脾淋巴细胞CD4+IL-17+T/CD4+T量变化规律与IL－17A表达量相同。2.Th17细胞分化在肺纤维化中的作用结果：①全反式维甲酸能抑制IL-17+CD4+T细胞分化和促进CD4+CD25+Treg的分化和抑制IL-17蛋白和mRNA的表达,降低脯氨酸含量,减轻博来霉素致小鼠肺纤维化程度；②全反式维甲酸能抑制小鼠肺纤维化组织TGF-p和IL-6mRNA表达,而对IL-10的表达无明显作用。3.IL-17对体外肺成纤维细胞的增殖、转化和分泌作用结果：①IL-17AR mRNA在博来霉素诱导肺纤维化形成中表达增加,14d达高峰；②IL-17能明显促进肺成纤维细胞的增殖、转化和胶原的合成。4.IL-17对体外siRNA-Act1转染肺成纤维细胞和NF-κB通路的作用结果：①25pmol浓度和培养48h时为siRNA-Act1转染肺成纤维细胞最佳剂量和时间点；②siRNA-Act1转染肺成纤维细胞Act1蛋白表达降低；③IL-17不能明显促进siRNA-Act1转染的肺成纤维细胞增殖、转化和胶原合成。④IL-17作用于siRNA-Act1非转染肺成纤维细胞,通过P65和IκB的磷酸化,激活NF-κB通路；IL-17作用于siRNA-Actl转染肺成纤维细胞Act1蛋白表达降低,抑制P65和IκB的磷酸化,从而抑制NF-κB通路。[研究结论]1.Th17细胞所分泌的IL-17A参与博来霉素致小鼠肺纤维化形成。2.IL-17A参与肺纤维化形成,可能与TGF-β、IL-6表达增加促进IL-17+CD4+T分化和抑制CD4+CD25+Treg的分化有关。3.全反式维甲酸可通过抑制TGF-β和IL-6表达,调节Th17与Treg细胞分化,降低IL-17的表达,减轻肺纤维化作用。4.IL-17具有促进肺成纤维细胞的增殖、转化和合成胶原作用。5. siRNA-Act1转染肺成纤维细胞,Act1蛋白表达降低,IL-17对siRNA-Act1转染的肺成纤维细胞增殖、转化和胶原合成无明显促进作用。6.IL-17作用于肺成纤维细胞,通过促进P65和IKB的磷酸化,激活NF-κB通路。7.IL-17对肺成纤维细胞作用,可能通过结合Act1蛋白,激活NF-κB通路有关；干扰Act1蛋白表达,抑制NF-κB通路,降低了IL-17对肺成纤维细胞的作用。