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精子是在睾丸曲细精管内完成,属于非常复杂的细胞分裂分化过程,为了使这一过程有条不紊的完成,需要曲细精管的内外信号、膜蛋白等对这一发生过程进行严格有序的调控。目前认为精子形成可能与生殖细胞电位的改变密切相关。精子为了获得受精能力需要完成以下几个步骤:附睾成熟、精子获能、超活化、趋向性,最后是精子的顶体反应。这些生理过程与细胞内外离子浓度变化有关。离子通道在精子形成过程中可以调节其内外的渗透压平衡,可以通过改变膜电位的变化推进精子的各种生理过程;受精过程中,精子外部环境会有很大的改变,离子通道就起了至关重要的作用,因此离子通道蛋白的表达、以及其功能的改变都会影响有性生殖物种雄性配子的发育以及受精能力。
中华绒螯蟹(学名:Eriocheirsinensis)的生活史比较复杂,其受精过程有别于其它物种,其个体的生活环境与其它物种也有很大的不同。中华绒螯蟹有一个非常重要的生理现象,即生殖洄游。淡水的离子浓度与海水的离子浓度有很大的不同,因此中华绒螯蟹在生殖迁移过程中经历了很强的离子浓度的变化。由此可见,离子浓度变化对中华绒螯蟹生殖发育起着不可或缺的作用。
钾通道为目前为止种类和亚型最多的离子通道。有报道称钾离子通道对精子的形成过程以及受精过程都有调节作用,SLO家族是钾通道一类非常特殊的通道,这类通道不仅具有电压依赖性,还对其它因素如Ca2+、Na+、Cl-、pH等具有敏感性。本文以中华绒螯蟹生精细胞为实验材料,采用Western blot、免疫组化、免疫荧光、PCR、基因克隆等技术对SLO家族蛋白进行组织及细胞定位和序列分析;用全细胞膜片钳技术分析生精细胞SLO通道的电生理特性和表达情况。结果如下:
(1)通过Western blot确定了SLO1存在于中华绒螯蟹精巢以及其它组织内,但是储精囊内的精子SLO1表达较少。SLO2在精巢的生精细胞和储精囊内的精子均有表达,但表达出现了差异性。
(2)对编码SLO1蛋白的基因克隆,并将测序的结果进行分析,发现slo1cDNA序列与其它物种有相似性较高,说明其保守性较强,且与拟穴青蟹的slo1最相近;克隆slo2.2的cDNA序列与其它物种虽有相似性,但是其保守性不是很高,与小鼠和和人类有很大的差异性,且与北黄道蟹(Cancerborealis)的slo2.2最相近,关系最为密切。
(3)采用全细胞膜片钳技术记录SLO1介导的钙激活钾通道和SLO2介导的钠激活钾通道:结果表明中华绒螯蟹生精细胞的钾电流包含钙激活钾电流。随后加入不同的阻断剂IbTX、CdCl2观察该电流,发现这些阻断剂均可以将钾电流进行阻断,根据阻断的结果分析SLO1蛋白主要表达于精原细胞和精母细胞,这与前期的SLO1蛋白的免疫定位结果一致;SLO2介导的钠激活钾通道也存在于中华绒螯蟹的生精细胞内,但是生精细胞对钠离子的依赖性不同,精子对钠离子的依赖性较强,而精原细胞、精母细胞、精细胞对钠离子的依赖性较弱,说明SLO2在生精细胞的表达存在差异性。
(4)观察SLO家族通道对精子的顶体反应的影响,发现钾通道不仅与精子的形成有关,而且还间接调节精子的顶体反应,SLO1与顶体反应相关,其不同抑制剂对顶体反应有不同的抑制作用;采用含不同浓度的钠离子作用于中华绒螯蟹的精子观察其顶体反应,发现钠离子和顶体反应没有直接的关系,这也间接说明SLO2的作用可能更多在精子能动性以及获能上面。
综上所述,中华绒螯蟹生精细胞内既有SLO1介导的钙激活钾电流,也有SLO2介导的钠激活钾电流。前者随着精子的形成分布越来越少;后者表现出精子对钠离子的敏感性与其它生精细胞不同,需要更高钠离子浓度才能激活,这与中华绒螯蟹生殖洄游环境密切相关。通过顶体反应诱导率实验发现,SLO1不仅与精子的形成有关,而且还间接调节精子的顶体反应,SLO1通道的关闭导致顶体反应的降低。SLO2的作用可能更多在精子能动性以及获能上面,需进一步试验进行验证。
中华绒螯蟹(学名:Eriocheirsinensis)的生活史比较复杂,其受精过程有别于其它物种,其个体的生活环境与其它物种也有很大的不同。中华绒螯蟹有一个非常重要的生理现象,即生殖洄游。淡水的离子浓度与海水的离子浓度有很大的不同,因此中华绒螯蟹在生殖迁移过程中经历了很强的离子浓度的变化。由此可见,离子浓度变化对中华绒螯蟹生殖发育起着不可或缺的作用。
钾通道为目前为止种类和亚型最多的离子通道。有报道称钾离子通道对精子的形成过程以及受精过程都有调节作用,SLO家族是钾通道一类非常特殊的通道,这类通道不仅具有电压依赖性,还对其它因素如Ca2+、Na+、Cl-、pH等具有敏感性。本文以中华绒螯蟹生精细胞为实验材料,采用Western blot、免疫组化、免疫荧光、PCR、基因克隆等技术对SLO家族蛋白进行组织及细胞定位和序列分析;用全细胞膜片钳技术分析生精细胞SLO通道的电生理特性和表达情况。结果如下:
(1)通过Western blot确定了SLO1存在于中华绒螯蟹精巢以及其它组织内,但是储精囊内的精子SLO1表达较少。SLO2在精巢的生精细胞和储精囊内的精子均有表达,但表达出现了差异性。
(2)对编码SLO1蛋白的基因克隆,并将测序的结果进行分析,发现slo1cDNA序列与其它物种有相似性较高,说明其保守性较强,且与拟穴青蟹的slo1最相近;克隆slo2.2的cDNA序列与其它物种虽有相似性,但是其保守性不是很高,与小鼠和和人类有很大的差异性,且与北黄道蟹(Cancerborealis)的slo2.2最相近,关系最为密切。
(3)采用全细胞膜片钳技术记录SLO1介导的钙激活钾通道和SLO2介导的钠激活钾通道:结果表明中华绒螯蟹生精细胞的钾电流包含钙激活钾电流。随后加入不同的阻断剂IbTX、CdCl2观察该电流,发现这些阻断剂均可以将钾电流进行阻断,根据阻断的结果分析SLO1蛋白主要表达于精原细胞和精母细胞,这与前期的SLO1蛋白的免疫定位结果一致;SLO2介导的钠激活钾通道也存在于中华绒螯蟹的生精细胞内,但是生精细胞对钠离子的依赖性不同,精子对钠离子的依赖性较强,而精原细胞、精母细胞、精细胞对钠离子的依赖性较弱,说明SLO2在生精细胞的表达存在差异性。
(4)观察SLO家族通道对精子的顶体反应的影响,发现钾通道不仅与精子的形成有关,而且还间接调节精子的顶体反应,SLO1与顶体反应相关,其不同抑制剂对顶体反应有不同的抑制作用;采用含不同浓度的钠离子作用于中华绒螯蟹的精子观察其顶体反应,发现钠离子和顶体反应没有直接的关系,这也间接说明SLO2的作用可能更多在精子能动性以及获能上面。
综上所述,中华绒螯蟹生精细胞内既有SLO1介导的钙激活钾电流,也有SLO2介导的钠激活钾电流。前者随着精子的形成分布越来越少;后者表现出精子对钠离子的敏感性与其它生精细胞不同,需要更高钠离子浓度才能激活,这与中华绒螯蟹生殖洄游环境密切相关。通过顶体反应诱导率实验发现,SLO1不仅与精子的形成有关,而且还间接调节精子的顶体反应,SLO1通道的关闭导致顶体反应的降低。SLO2的作用可能更多在精子能动性以及获能上面,需进一步试验进行验证。