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研究背景及目的：
视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma, RB)是婴幼儿时期发生的眼内恶性肿瘤，可导致视网膜脱离、坏死、并侵犯视神经系统。据统计约45%的患儿经保守治疗后肿瘤复发，手术结合化疗是目前Rb的主要治疗方案，但RB耐药常导致治疗效果较差。因此，明确RB发生发展及药物敏感性影响机制对RB的治疗有重要临床意义。
高迁移率族蛋白1(High mobility group box-1 protein, HMGB1)是一种高移动性核染色质蛋白，可诱导小血管的形成加速肿瘤增长，并能提高组织纤溶酶原活化促进肿瘤的浸润与转移。也有研究认为HMGB1能激活T细胞免疫反应而发挥抗肿瘤效应。明确HMGB1对RB肿瘤增殖、分化等生物学行为的影响是本研究的方向。目前已有关于HMGB1在骨肉瘤、胶质瘤等多种肿瘤药物敏感性的作用研究，尚无针对HMGB1在RB耐药中的作用机制研究。作为HMGB1受体RAGE和TLR-4作用的共同途径，NF-κB信号通路能调控细胞凋亡和自噬影响肿瘤药物敏感性。我们推断，NF-κB信号通路介导的细胞自噬与凋亡可能是HMGB1影响RB药物敏感性的作用机制。
基于此，本研究拟从临床、细胞及整体水平对HMGB1在RB生物学行为和化疗药物敏感性中的作用进行研究，并探讨NF-κB信号通路在HMGB1影响RB药物敏感性中的作用机制，以期为提高RB的临床药物治疗效果提供研究基础。
第一部分HMGB1在视网膜母细胞瘤生物学行为中的作用研究
目的：
分析HMGB1在RB组织或细胞中的表达情况，探讨HMGB1对RB细胞增殖、侵袭及凋亡等生物学行为的影响。
方法：
1、收集临床RB组织及正常视网膜组织，检测比较HMGB1蛋白表达情况；同时检测分析视网膜母细胞瘤细胞株Y79和正常视网膜色素上皮细胞APRE-19中HMGB1蛋白表达差异。
2、以Y79细胞株为研究对象，通过构建转染siRNAHMGB1干扰细胞HMGB1表达。利用免疫荧光和WesternBlotting法检测细胞慢病毒转染及HMGB1表达情况；并检测分析Y79细胞增殖、细胞周期、侵袭能力及细胞凋亡情况，以分析干扰HMGB1对Y79细胞相关恶性生物学行为的影响。
结果：
1、RB组织中HMGB1表达明显高于正常视网膜组织，且Y79细胞中HMGB1水平明显高于ARPE-19细胞，提示HMGB1与RB的发生发展相关。
2、利用免疫荧光、蛋白定量检测及细胞抑制情况分析siRNAHMGB转染条件，确定转染剂量为5MOI，转染时间36小时为siRNAHMGB1转染实验条件。
3、干扰HMGB1影响Y79细胞周期，G0/G1期比例显著增高，S期和G2/M期则显著减少，即干扰HMGB1能改变细胞周期而抑制增殖。
4、干扰HMGB1影响Y79细胞侵袭能力。与Control组和siRNANC组比较，siRNAHMGB1组Y79细胞侵袭能力显著降低。
5、干扰HMGB1影响Y79细胞凋亡。与Control组和siRNANC组比较，siRNAHMGB1组细胞凋亡率明显提高，及干扰HMGB1能促进RB细胞凋亡。
结论：
1、HMGB1在RB组织和细胞中均高表达，提示对RB的发生发展有促肿瘤作用；
2、干扰HMGB1能抑制Y79细胞的增殖、迁移与侵袭及引起细胞周期阻滞，对RB肿瘤的恶性生物学行为有重要调控作用；
第二部分HMGBl在视网膜母细胞瘤化疗药物敏感性中的作用研究
目的：
明确干扰HMGB1对RB化疗药物敏感性的影响，并探讨HMGB1影响RB药物敏感性的机制。
方法：
1、检测化疗药物VCR、ETO及CBP对Weri-Rb-1和Y79细胞HMGB1表达水平的影响；并通过siRNAHMGB1干扰RB细胞HMGB1表达。
2、检测分析转染siRNAHMGB1对VCR诱导的Weri-Rb-1和Y79细胞增殖、细胞活力及细胞凋亡的影响；明确干扰HMGB1对RB药物敏感性的作用。
3、结合使用NF-κB特异性抑制剂PDTC，通过观察LC3斑块数量、检测cleavedcaspase-3和cleavedPARP水平，及beclin1和p62水平分析HMGB1?NF-κB信号机制对RB细胞凋亡与自噬的影响，以探讨HMGB1影响RB细胞药物敏感性的机制。
结果：
1、Weri-Rb-1和Y79细胞经VCR、ETO及CBP处理后HMGB1蛋白和mRNA水平均显著增高(P<0.05)；而干扰HMGB1表达可以逆转VCR引起的HMGB1表达增高。
2、Weri-Rb-1和Y79细胞转染siRNAHMGB1后对VCR的IC50值均明显降低，即干扰HMGB1增强VCR对Weri-Rb-1和Y79细胞增殖的抑制。
3、siRNAHMGB1增强VCR对Weri-Rb-1和Y79细胞活性的抑制。细胞活力在一定范围内均随着VCR剂量的增加而降低，而VCR+siRNAHMGB1组细胞活力抑制更显著，最大抑制强度也明显增高。
4、siRNAHMGB1提高VCR诱导的RB细胞凋亡。Hoechst染色结果显示，siRNAHMGB1转染促进了VCR处理后Y79细胞的凋亡，且这种作用与NF-κB特异性抑制剂PDTC作用效果一致。
5、Y79细胞经VCR处理后cleavedcaspase-3和cleavedPARP的表达水平显著降低(P<0.05)；然而，与siRNANC组比较，siRNAHMGB1和PDTC预处理能逆转VCR处理引起的cleavedcaspase-3和cleavedPARP水平降低。
6、Y79细胞转染siRNAHMGB1和PDTC能逆转VCR引起的Beclin1增高及p62降低。
结论：
干扰HMGB1表达能通过抑制NF-κB促进RB细胞凋亡、抑制细胞自噬增强RB细胞化疗药物敏感性。
第三部分HMGB1在视网膜母细胞瘤恶性行为及药物敏感性的作用体内实验
目的：
从整体动物水平验证研究HMGB1在视网膜母细胞瘤恶性生物学行为和在化疗药物敏感性中的作用及机制。
方法：
培养Y79细胞株和siRNAHMGB1稳转的Y79细胞株，并通过皮下注射构建体内RB移植瘤模型。分析比较两组小鼠RB肿瘤的生长情况；并结合使用化疗药物(VCR)探讨验证HMGB1对RB肿瘤化疗药物敏感性的影响。
结果：
1、成功构建裸鼠成瘤模型，siRNAHMGB1组肿瘤体积和重量明显小于Control组，抑瘤率约为65.29%，表明干扰HMGB1表达能抑制RB肿瘤的生长。
2、siRNAHMGB1+VCR组小鼠肿瘤体积明显低于siRNAHMGB1组和VCR组；VCR组小鼠肿瘤体积则低于siRNAHMGB1组；VCR组肿瘤重量明显低于siRNAHMGB1组，siRNAHMGB1+VCR组裸鼠肿瘤重量明显低于siRNAHMGB1组和VCR组。
结论：
从整体动物水平证实干扰HMGB1能影响RB肿瘤的生长，并能提高RB肿瘤对化疗药物的敏感性。
视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma, RB)是婴幼儿时期发生的眼内恶性肿瘤，可导致视网膜脱离、坏死、并侵犯视神经系统。据统计约45%的患儿经保守治疗后肿瘤复发，手术结合化疗是目前Rb的主要治疗方案，但RB耐药常导致治疗效果较差。因此，明确RB发生发展及药物敏感性影响机制对RB的治疗有重要临床意义。
高迁移率族蛋白1(High mobility group box-1 protein, HMGB1)是一种高移动性核染色质蛋白，可诱导小血管的形成加速肿瘤增长，并能提高组织纤溶酶原活化促进肿瘤的浸润与转移。也有研究认为HMGB1能激活T细胞免疫反应而发挥抗肿瘤效应。明确HMGB1对RB肿瘤增殖、分化等生物学行为的影响是本研究的方向。目前已有关于HMGB1在骨肉瘤、胶质瘤等多种肿瘤药物敏感性的作用研究，尚无针对HMGB1在RB耐药中的作用机制研究。作为HMGB1受体RAGE和TLR-4作用的共同途径，NF-κB信号通路能调控细胞凋亡和自噬影响肿瘤药物敏感性。我们推断，NF-κB信号通路介导的细胞自噬与凋亡可能是HMGB1影响RB药物敏感性的作用机制。
基于此，本研究拟从临床、细胞及整体水平对HMGB1在RB生物学行为和化疗药物敏感性中的作用进行研究，并探讨NF-κB信号通路在HMGB1影响RB药物敏感性中的作用机制，以期为提高RB的临床药物治疗效果提供研究基础。
第一部分HMGB1在视网膜母细胞瘤生物学行为中的作用研究
目的：
分析HMGB1在RB组织或细胞中的表达情况，探讨HMGB1对RB细胞增殖、侵袭及凋亡等生物学行为的影响。
方法：
1、收集临床RB组织及正常视网膜组织，检测比较HMGB1蛋白表达情况；同时检测分析视网膜母细胞瘤细胞株Y79和正常视网膜色素上皮细胞APRE-19中HMGB1蛋白表达差异。
2、以Y79细胞株为研究对象，通过构建转染siRNAHMGB1干扰细胞HMGB1表达。利用免疫荧光和WesternBlotting法检测细胞慢病毒转染及HMGB1表达情况；并检测分析Y79细胞增殖、细胞周期、侵袭能力及细胞凋亡情况，以分析干扰HMGB1对Y79细胞相关恶性生物学行为的影响。
结果：
1、RB组织中HMGB1表达明显高于正常视网膜组织，且Y79细胞中HMGB1水平明显高于ARPE-19细胞，提示HMGB1与RB的发生发展相关。
2、利用免疫荧光、蛋白定量检测及细胞抑制情况分析siRNAHMGB转染条件，确定转染剂量为5MOI，转染时间36小时为siRNAHMGB1转染实验条件。
3、干扰HMGB1影响Y79细胞周期，G0/G1期比例显著增高，S期和G2/M期则显著减少，即干扰HMGB1能改变细胞周期而抑制增殖。
4、干扰HMGB1影响Y79细胞侵袭能力。与Control组和siRNANC组比较，siRNAHMGB1组Y79细胞侵袭能力显著降低。
5、干扰HMGB1影响Y79细胞凋亡。与Control组和siRNANC组比较，siRNAHMGB1组细胞凋亡率明显提高，及干扰HMGB1能促进RB细胞凋亡。
结论：
1、HMGB1在RB组织和细胞中均高表达，提示对RB的发生发展有促肿瘤作用；
2、干扰HMGB1能抑制Y79细胞的增殖、迁移与侵袭及引起细胞周期阻滞，对RB肿瘤的恶性生物学行为有重要调控作用；
第二部分HMGBl在视网膜母细胞瘤化疗药物敏感性中的作用研究
目的：
明确干扰HMGB1对RB化疗药物敏感性的影响，并探讨HMGB1影响RB药物敏感性的机制。
方法：
1、检测化疗药物VCR、ETO及CBP对Weri-Rb-1和Y79细胞HMGB1表达水平的影响；并通过siRNAHMGB1干扰RB细胞HMGB1表达。
2、检测分析转染siRNAHMGB1对VCR诱导的Weri-Rb-1和Y79细胞增殖、细胞活力及细胞凋亡的影响；明确干扰HMGB1对RB药物敏感性的作用。
3、结合使用NF-κB特异性抑制剂PDTC，通过观察LC3斑块数量、检测cleavedcaspase-3和cleavedPARP水平，及beclin1和p62水平分析HMGB1?NF-κB信号机制对RB细胞凋亡与自噬的影响，以探讨HMGB1影响RB细胞药物敏感性的机制。
结果：
1、Weri-Rb-1和Y79细胞经VCR、ETO及CBP处理后HMGB1蛋白和mRNA水平均显著增高(P<0.05)；而干扰HMGB1表达可以逆转VCR引起的HMGB1表达增高。
2、Weri-Rb-1和Y79细胞转染siRNAHMGB1后对VCR的IC50值均明显降低，即干扰HMGB1增强VCR对Weri-Rb-1和Y79细胞增殖的抑制。
3、siRNAHMGB1增强VCR对Weri-Rb-1和Y79细胞活性的抑制。细胞活力在一定范围内均随着VCR剂量的增加而降低，而VCR+siRNAHMGB1组细胞活力抑制更显著，最大抑制强度也明显增高。
4、siRNAHMGB1提高VCR诱导的RB细胞凋亡。Hoechst染色结果显示，siRNAHMGB1转染促进了VCR处理后Y79细胞的凋亡，且这种作用与NF-κB特异性抑制剂PDTC作用效果一致。
5、Y79细胞经VCR处理后cleavedcaspase-3和cleavedPARP的表达水平显著降低(P<0.05)；然而，与siRNANC组比较，siRNAHMGB1和PDTC预处理能逆转VCR处理引起的cleavedcaspase-3和cleavedPARP水平降低。
6、Y79细胞转染siRNAHMGB1和PDTC能逆转VCR引起的Beclin1增高及p62降低。
结论：
干扰HMGB1表达能通过抑制NF-κB促进RB细胞凋亡、抑制细胞自噬增强RB细胞化疗药物敏感性。
第三部分HMGB1在视网膜母细胞瘤恶性行为及药物敏感性的作用体内实验
目的：
从整体动物水平验证研究HMGB1在视网膜母细胞瘤恶性生物学行为和在化疗药物敏感性中的作用及机制。
方法：
培养Y79细胞株和siRNAHMGB1稳转的Y79细胞株，并通过皮下注射构建体内RB移植瘤模型。分析比较两组小鼠RB肿瘤的生长情况；并结合使用化疗药物(VCR)探讨验证HMGB1对RB肿瘤化疗药物敏感性的影响。
结果：
1、成功构建裸鼠成瘤模型，siRNAHMGB1组肿瘤体积和重量明显小于Control组，抑瘤率约为65.29%，表明干扰HMGB1表达能抑制RB肿瘤的生长。
2、siRNAHMGB1+VCR组小鼠肿瘤体积明显低于siRNAHMGB1组和VCR组；VCR组小鼠肿瘤体积则低于siRNAHMGB1组；VCR组肿瘤重量明显低于siRNAHMGB1组，siRNAHMGB1+VCR组裸鼠肿瘤重量明显低于siRNAHMGB1组和VCR组。
结论：
从整体动物水平证实干扰HMGB1能影响RB肿瘤的生长，并能提高RB肿瘤对化疗药物的敏感性。