【摘 要】
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目的:建立适用于本实验室的寨卡病毒感染细胞及动物模型,初步测定中药黄芩多种主要有效成分的抗寨卡病毒活性,以期建立从细胞、动物水平评价中药提取物和小分子化合物对寨卡病毒抑制能力的药理药效评价体系,筛选具有高效低毒的抗寨卡病毒药物,为进一步研究抗寨卡病毒的药效机制奠定基础。方法:1.培养C6/36细胞扩增寨卡病毒,并通过噬斑实验测定实验室寨卡病毒的滴度。2.寨卡病毒梯度浓度感染Vero、Hela细胞,
【基金项目】
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广东省自然科学基金研究团队项目“治疗病毒性肺损伤的岭南特色中药药效物质基础研究”（S2012030006598）；
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目的:建立适用于本实验室的寨卡病毒感染细胞及动物模型,初步测定中药黄芩多种主要有效成分的抗寨卡病毒活性,以期建立从细胞、动物水平评价中药提取物和小分子化合物对寨卡病毒抑制能力的药理药效评价体系,筛选具有高效低毒的抗寨卡病毒药物,为进一步研究抗寨卡病毒的药效机制奠定基础。方法:1.培养C6/36细胞扩增寨卡病毒,并通过噬斑实验测定实验室寨卡病毒的滴度。2.寨卡病毒梯度浓度感染Vero、Hela细胞,分别使用荧光定量PCR检测病毒感染后48h的RNA水平、蛋白免疫印迹法检测病毒蛋白质水平表达,摸索合适的感染滴度。3.寨卡病毒分别腹腔感染BALB/c和C57BL/6免疫正常小鼠、C57BL/6免疫缺陷小鼠,记录每日体重及状态,眼底静脉丛取血检测攻毒1～4d病毒血症情况。4.CCK-8测定药物细胞毒性、荧光定量PCR测定药物抗寨卡病毒活性。Vero细胞加入药物孵育1h,孵育后加入感染复数（multiplicity of infection）MOI=0.05的寨卡病毒,感染1h后弃去,重新加药培养48h检测病毒RNA含量。结果:1.噬斑实验测定C6/36细胞扩增的寨卡病毒滴度PFU=1×107pfu/m L。2.寨卡病毒感染Vero细胞48h,荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法能够检测寨卡病毒MOI=0.05的病毒高复制水平,寨卡病毒感染Hela细胞48h,荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法能够检测寨卡病毒MOI=0.5的病毒高复制水平。3.BALB/c和C57BL/6免疫正常小鼠寨卡病毒感染后状态、体重均无明显变化,不出现病毒血症;C57BL/6免疫缺陷小鼠感染后1d即出现病毒血症,2d到达峰值,小鼠体重随感染天数逐渐下降,直至死亡或实验结束。4.除黄芩素CC50=43.3μM以外,黄芩苷、汉黄芩苷、野黄芩苷CC50>400μM。除汉黄芩苷不能抑制寨卡病毒复制,黄芩苷、黄芩素、野黄芩苷均能体现抗寨卡病毒活性,黄芩素EC50=0.1μM,黄芩苷EC50=5.6μM,野黄芩苷EC50=58.0μM。结论:1.寨卡病毒能够感染Vero和Hela细胞,并能在48h后通过荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法能够检测寨卡病毒的复制,Vero、Hela细胞适宜的抗寨卡病毒药物筛选感染滴度分别是MOI=0.05、MOI=0.5。2.寨卡病毒不能感染BALB/c和C57BL/6免疫正常小鼠;可以感染C57BL/6免疫缺陷小鼠并出现体重下降、病毒血症、甚至死亡等一系列感染症状。3.黄芩素、黄芩苷均表现出良好的抗寨卡病毒感染活性,需要后续的动物实验进行更深入的抗病毒作用评价,优选出最佳药物作抗寨卡病毒药理药效机制研究。
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