目的:喉癌(laryngeal carcinoma)是耳鼻咽喉-头颈外科常见的恶性肿瘤之一,在全世界范围内的头颈部肿瘤中大约占26%-30%[1]。近年来,随着吸烟人群的增多和环境的逐渐恶化,喉癌的发病率日趋增加,对人类健康、生命的威胁日益增加。随着现代医学及实验技术的发展,近几年来已有学者提出线粒体DNA(mitochondria DNA,mt DNA)发生了变异是肿瘤发生发展的重要原因之一,与肿瘤的发生与发展有着不可或缺的紧密关系。线粒体DNA是高等动物中核外遗传物质的唯一存在场所,人类mtDNA是由16569个碱基组成的双链闭合分子结构,包含13种多肽编码基因、2种核糖体RNA基因和22种转运RNA基因,在线粒体蛋白质的合成过程中发挥重要作用。D-loop区是人类线粒体DNA的一段非编码区域,位于mt DNA 16024bp-576bp,在整个mtDNA序列中仅占6%,但其发生突变的几率以及多态性却较其他区域明显增高,该区包含复制起始点、转录启动子等在mt DNA复制与转录过程中的起主导作用的重要结构,因此控制着mt DNA的复制与转录。本研究采用PCR和DNA测序的方法,对71例喉癌患者D-loop区的基因序列进行检测,分析探索D-loop区单核苷酸多态性与喉癌发生发展的关系,为喉癌的早期诊断、治疗与预后判断提供新途径。方法:1研究对象及标本采集:选取2013年6月至2016年11月于河北医科大学第四医院耳鼻咽喉-头颈外科住院并行手术治疗的71例喉癌患者作为本研究的对象,年龄在39-73岁,均为男性。在获取患者及家属知情同意后,采集患者外周静脉血3ml,将其放置在-4度冰箱内冷藏保存,总计71例。此外,选取2012年至2013年间159例在河北医科大学第四医院体检的正常人作为对照组,将体检资料做详细记录,并在取得本人的知情同意后采集外周静脉血标本3ml。所有标本的采集均由河北医科大学第四医院伦理办公室的委员会审核、同意并批准。2实验及分析方法:使用dna纯化试剂盒对喉癌患者外周静脉血以及正常对照组外周静脉血标本进行线粒体dna提取,需进行定量鉴定,经鉴定达标后对标本组织进一步做聚合酶链反应(polymerasechainreaction,pcr),使设计的mtdnad-loop区的目的片段得以扩增,并对扩增产物进行dna测序,同一标本采用双向重复测序。将结果与目前公认的剑桥标准序列作对比、分析(blast),总结mtdnad-loop区突变与喉癌的关系。3统计分析:实验数据采用spss21.0统计软件对计数资料应用X2检验计算p值,相对危险度(or值)及95%可信区间(ci),p<0.05则差异有统计学意义。结果:1将喉癌组与对照组的临床资料作比对发现:二者的性别与吸烟史有统计学差异(p<0.05)。二者<40岁与≥40岁的分布频数无显著性差异(p>0.05)。2参照被公认为标准的racambridge序列,在71例喉癌组与159例对照组中的982bp的测序结果中共发现146个多态性改变,多态率为14.9%,其中有2个位点为新发现的多态性位点。喉癌组与对照组共发现25个高频多态性位点。3用X2检验对喉癌组与正常对照组mtdnad-loop区的单核苷酸多态性的分布频率作比对,发现73g/a、309c/cinsert、315c/cinsert、524c/del、556a/del、16288c/t、16291t/c、16311c/t、16319a/g这9个多态性变异位点与喉癌的发病相关。在73位点,喉癌组有71例(100.0%)患者出现a碱基被g碱基替换,正常对照组出现了89例(56%),73g基因型在喉癌组的分布频率明显高于对照组,差异有统计学意义(p<0.01)。在309位点,喉癌组有24例(33.8%)患者出现1个c碱基插入,而在正常对照组出现了116例(73.0%),309cinsert基因型在喉癌组的分布频率明显低于对照组,差异有统计学意义(p<0.01)。在315位点,有30例(42.3%)喉癌患者出现c碱基插入,正常对照组中有149例(93.7%)出现c碱基插入现象,315cinsert基因型在喉癌组的分布频率显著低于对照组,差异有统计学意义(p<0.01)。在524位点,喉癌组出现c碱基缺失的有20例(28.2%),对照组有1例(0.6%),524cdel基因型在喉癌组分布频率明显高于对照组,差异有统计学意义(p<0.01)。在556位点,喉癌组有6例(8.5%)存在a碱基缺失,对照组无a碱基缺失,556adel基因型在喉癌组的分布频率明显高于对照组,差异有统计学意义(p<0.01)。在16288位点,喉癌组有4例(5.6%)存在t碱基被c碱基替换,对照组无改变,16288c基因型在喉癌组的分布频率明显高于对照组,差异有统计学意义(p=0.013)。在16291位点,喉癌组有8例(11.3%)出现c碱基被t碱基替换,对照组出现2例(1.3%),16291t基因型在喉癌组的分布频率明显高于对照组,差异有统计学意义(p=0.020)。在16311位点,喉癌组有14例(19.7%)出现t碱基被c碱基替换,对照组有15例(9.4%),16311c基因型在喉癌组的分布频率高于对照组,差异有统计学意义(p=0.030)。在16319a位点,喉癌组有4例(5.6%)出现g碱基被a碱基替换,对照组有25例(15.7%),16319a基因型在喉癌组的分布频率明显低于对照组,差异有统计学意义(p=0.033)。4把与喉癌相关的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms,snps)分别同患者的临床特征作比较,结果示16291t基因型在有淋巴结转移组(37.5%)中的分布频率较无淋巴结转移组(3.6%)高,差别有统计学意义(p<0.01)。其他与喉癌发病相关的snps和患者肿瘤直径大小、分化程度、临床分型、淋巴结转移情况及uicctnm分期等临床特征无关,差别无统计学意义(p>0.05)。结论:1喉癌多发生于常年吸烟的男性。2喉癌患者的d-loop区具有高度多态性,高频多态性位点在hv1、hv2、hv3这三个高变区均有分布,多态性的主要形式单碱基的置换,部分表现为插入与缺失。3在所有喉癌样本中均发现了73g/a这一改变,稳定性有待于进一步研究。4 mtDNA D-Loop区的SNPs与喉癌发病风险有相关性,73G、524del、556del、16288C、16291T以及16311C基因型可能增加了喉癌的发病风险,而309 C insert、315 C insert、16319A基因型可能降低了喉癌的发病风险。5 D-Loop区基因的多态性改变在喉癌发生发展过程中有可能是个早期事件,这种多态性改变与喉癌患者临床特征无相关性。mtDNA D-Loop区多态性位点有望成为喉癌早期诊断的分子标记,可能会为肿瘤诊断提供新的理论依据。