骨性关节炎(osteoarthritis,OA)是目前全球范围中老年人最常见的骨关节退行性疾病,也是引发关节疼痛、关节功能丧失甚至导致残疾的最常见骨关节疾病。流行病学调查表明,40岁以上人群原发性OA的总患病率为46.3%,且呈现随年龄增长而增高的趋势。目前临床上治疗OA的保守方法和效果有限,最终还是需要进行关节置换手术。然而手术带来的并发症对患者来说都是灾难性的后果。OA的治疗及疾病发展所致的残疾都给家庭和社会带来极大的经济负担。因此,探索关节软骨退行性变的有效防治措施、阻断OA发生进程是临床亟需解决的热点问题。在OA的进展过程中,以软骨下骨的病变最先开始出现,主要表现为骨质重塑增加、软骨下骨硬化、软骨下骨板变厚、骨小梁微结构破坏以及骨质的流失。软骨下骨的病变继而导致关节软骨的一些变化,包括软骨细胞增生、基质降解蛋白酶的合成增多、软骨细胞表型缺失、关节软骨厚度变薄等等。作为力学支持结构,软骨下骨的硬化也导致关节软骨就吸收更多的应力,导致软骨表型改变,基质降解,软骨退变的发生。也有研究认为,OA的发展过程中尽管软骨下骨的骨重建增强,但因骨重建增加所致的局部矿化不足,引起软骨下骨的弹性系数降低,导致其上方的关节软骨在机械力或负荷作用下变形甚至开裂。异常的力学作用如何导致软骨下骨重塑的改变,以及如何进一步导致软骨退变,目前尚无定论。高强度运动,比如马拉松、过度负重等竞技项目,是否会对关节软骨产生不可逆的破坏,至今尚无定论。虽然流行病学统计调查发现长跑运动员中OA的患病率与正常人的群体并无统计学差别,但是,许多动物实验和临床研究发现长跑运动员的膝关节会出现MRI(magnetic resonance imaging)可检测的,且与持续性膝关节疼痛有关的病变。另外,大量的动物实验也证明,不仅是高强度的跑步运动,其他一些被动的重复执行的运动,也可以导致膝关节软骨下骨骨质代谢改变、关节软骨的破坏,诱导OA的发生。因此,为了探讨过度运动是否会对膝关节软骨产生损伤,并深入研究其相关的软骨下骨和关节软骨的反应机制,我们进行了本次研究。我们将研究分成三部分,第一部分:明确高强度运动是否会导致膝关节软骨下骨重塑改变和软骨退变;第二部分:探索在高强度运动的条件下,骨祖细胞定向募集异常导致软骨下骨重塑增加的机制;第三部分:研究骨-软骨复合体之间的物质运输异常导致关节软骨退变的机制。第一部分高强度运动导致膝关节软骨下骨重塑改变和软骨退变[背景]在类似于马拉松的竞技运动中,长期高强度跑步运动是否会导致膝关节损伤目前仍存在有争议。[目的]为了明确高强度跑步运动对于膝关节软骨下骨和关节软骨的影响。[方法和结果]将C57BL/6小鼠分成3个组,为对照组、中等强度组和高强度组,分别进行不同强度的跑步运动,4周后进行膝关节MRI检查,在T2加权脂肪抑制序列上观察软骨下骨内信号,结果发现随着运动强度的增加,胫骨和股骨髁髓腔内的信号都逐渐上升,统计量化指标显示,高强度组的相对信号值明显高于对照组(P=0.017和P=0.024)。在第5周处死小鼠,对小鼠的膝关节进行Micro-CT扫描,分析计算软骨下骨的形态学参数,发现显示小鼠胫骨软骨下骨骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)(P=0.031 和P=0.0034)和骨小梁数量(trabecular number,Tb.N)明显高于对照组和中等强度组(P值均<0.001);骨小梁间隙(trabecular space,Tb.Sp)明显低于对照组和中等强度组(P均<0.001)。对小鼠膝关节标本进行番红-固绿染色、HE染色,结果提示:高强度运动组的膝关节软骨面不平整,黏多糖染色出现局部丢失,高强度组钙化软骨层内的肥大软骨细胞数量明显高于对照组(P=0.025),同时钙化软骨层体积(P<0.001)和厚度(P=0.005)均高于对照组。不仅在钙化软骨层参数出现变化,高强度组的软骨下骨板厚度较对照组(P<0.001)和中等强度组(P=0.009)均明显升高。[结论]高强度运动可导致膝关节软骨下骨内骨髓损伤,并且软骨下骨骨小梁出现重塑异常和软骨表征的改变。需要进一步研究高强度运动导致这些改变的具体机制。第二部分骨祖细胞募集异常导致软骨下骨重塑失衡的机制研究[背景]我们在第一部分的研究中发现了高强度运动可导致软骨下骨骨小梁骨重塑异常,而目前关于此现象的具体机制尚无定论;相关研究认为骨祖细胞的募集对于骨形成具有重要作用,据此我们提出假说,高强度运动所致的骨重塑增加与骨髓腔内骨祖细胞的异常募集有关。[目的]进一步研究软骨下骨髓腔内骨祖细胞的异常募集在软骨下骨骨质重塑失衡的作用机制。[方法和结果]三维重建膝关节的CT数据,高强度运动组的骨体积/组织体积(BV/TV)较对照组(P=0.0048)和中等强度(P=0.015)组明显增高(A,B)。用第一部分所获得的标本进行免疫组织化学和Goldner三色染色,结果显示强度组软骨下骨内膜表面的OCN表达明显上升(P<0.001),胫骨软骨下骨成骨活性明显高于其余两组,但出现大片的类骨质和未矿化骨,同时破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色结果提示软骨下骨内破骨细胞活性组间无统计学差异(P=0.21)。为了明确骨祖细胞在髓腔内的分布,在跑步5周后对膝关节软骨下骨髓腔内的细胞进行流式细胞检测,发现过度运动后小鼠软骨下骨表面的骨祖细胞(endosteal mesenchymal progenitor,EMP)占总细胞的百分比数较对照组明显增加(P=0.034),细胞集落培养(CFU)的结果也表明高强度运动组的骨祖细胞集落数相对值较对照组(P=0.028)和中等强度组(P=0.037)增多,但髓腔内间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的集落数较中等强度组(P=0.0048)和对照组明显减少(P=0.044)。为了体外模拟高强度应力对细胞的作用,提取膝关节软骨下骨髓腔内的骨祖细胞培养,用细胞牵拉器予贴壁细胞不同强度的应力刺激,分别是0%应变0 Hz频率(对照)、5%应变0.5 Hz频率(5%,0.5 Hz),20%应变1 Hz频率(20%,1 Hz),通过划痕实验我们发现骨祖细胞的迁移能力随应力刺激强度的增加而下降。为了明确骨祖细胞的迁移和募集异常是否与初级纤毛的形成和功能障碍有关,我们运用流式细胞技术发现高强度应力作用明显抑制了组装初级纤毛的重要成分——α-Tubulin在骨祖细胞中的表达。并且,α-Tubulin合成的驱动因子KIF3A在软骨下骨内的基因表达也出现下调(P=0.0029)。进一步利用免疫印迹(western blot)检测发现与KIF3A合成相关的激动因子PKA-C在高强度应力刺激后表达下调。利用免疫定量检测试剂盒和实时定量聚合连反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)实验发现,高强度运动明显抑制软骨下骨内cAMP和AC6的表达(P均<0.05)。[结论]高强度运动刺激软骨下骨内的AC6表达受抑制,从而抑制cAMP/PKA/KIF3A信号通路,导致α-Tubulin合成下降,骨祖细胞初级纤毛组装和功能受损,出现过度募集于软骨下骨,促使软骨下骨质重塑。第三部分 高强度运动通过抑制软骨下骨PDGF-AA生成导致关节软骨退变机制研究[背景]在第一部分的研究中证实了高强度运动可导致关节软骨退变,同时很多研究认为骨-软骨复合体之间的物质传输在关节软骨退变中具有重要作用。血小板源性生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)-AA是促进细胞存活,调控细胞分化的重要因子,而PDGF/Akt在骨-软骨复合体中的作用目前尚无相关报道。[目的]明确在高强度运动作用下软骨下骨代谢变化如何导致关节软骨终末分化以及软骨退变。[方法和结果]为了明确高强度运动后关节软骨的表型特征,利用免疫组化检测COL10和MMP13在关节软骨内的表达水平,结果显示高强度运动组的钙化软骨层内COL10和MMP13阳性细胞数均高于对照组(P均<0.001)和中等强度组(P=0.0052和<0.001),同时TUNEL试剂盒检测发现高强度组的凋亡细胞数量较对照组(P=0.002)和中等强度组(P=0.007)明显增多。提取小鼠膝关节软骨下骨的mRNA进行RT-PCR,发现高强度运动可明显抑制软骨下骨内Pdgfa的表达(P均<0.01),该结果在免疫组化实验中也得到验证。为了进一步明确是否高强度应力刺激抑制了软骨下骨内的成骨细胞合成PDGF-AA,从而导致了上层软骨的病变,体外培养MC3T3前成骨细胞并进行不同强度的应力刺激,以模拟软骨下骨的应力环境。随着应力刺激强度的增加,PDGF-AA的基因和蛋白表达水平下降(P均<0.05);同时收集刺激后的条件培养基共培养软骨细胞(mechanical treatment,MT),培养 3 天后细胞 Mmp13、Col10a1 的表达上调(P均<0.05),而条件培养基中加入10ng/mL PDGF-AA(MT+PDGF)后共培养可逆转此现象(P均<0.05)。共培养后细胞凋亡染色显示类似结果:MT+PDGF可明显抑制MT共培养导致的软骨细胞死亡(P均<0.05),说明PDGF-AA合成减少导致了软骨细胞的终末分化和凋亡。继续深入研究发现,高强度运动不仅抑制软骨下骨PDGF-AA的表达,关节软骨内p-Akt的活性也受到抑制(P=0.018),体外实验同样证实,软骨细胞经MT条件培养基共培养后,Akt的磷酸化水平下降,而加入PDGF-AA后得到磷酸化水平恢复。[结论]在高强度运动状态下,从软骨下骨内向关节软骨定向运输的PDGF-AA和关节软骨内PDGF/Akt信号通路的活性受到抑制,而这些对于关节软骨表型的保持,延缓软骨细胞终末分化和凋亡具有重要的作用。