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肌酐是检测肾小球滤过作用的重要指示物质,及时准确地诊断肾脏状况对肾病的治疗和康复具有重要的意义。在目前肌酐临床检测的方法中,酶学检测肌酐的方法得到广泛的应用。其原理是偶联肌酐酶(CA)、肌酸酶(CI)和肌氨酸氧化酶(SOX)的酶催化反应,通过对产物H2O2的检测,以确定样品中肌酐的含量。为了开发成本低、效率高的肌酐检测试剂盒,基于以上原理,本论文运用酿酒酵母孢子微胶囊固定化酶技术对肌酐降解酶系中的CA、CI和SOX进行了固定化,形成了孢子固定化酶微胶囊。其优点是:无需对纯酶进行提取,使成本大幅降低,且操作简单,室温储存性能好,抗逆性能强,pH和温度作用范围广泛,可实现对多种酶的共同固定化等。本论文开展了酿酒酵母孢子对以上三种酶的微胶囊固定化研究,为肌酐检测试剂盒的研发做好理论铺垫。主要研究内容如下:首先,利用酿酒酵母孢子微胶囊固定化技术,分别对来源于假单胞菌PS-7(Pseudomonas sp.PS-7)的CA、来源于恶臭假单胞菌KT2440(Pseudomonas putida KT2440)的CI和来源于芽孢杆菌NS-129(Bacillus sp.NS-129)的SOX进行了单酶固定化研究。把上述基因分别转化入酵母细胞中,诱导产孢后,对孢子分离纯化,经冷冻干燥后就可得到孢子固定化酶。通过蛋白免疫印迹和酶活分析,证实了以上三种酶分别在酵母孢子壁中成功固定。孢子固定化酶比未经孢子固定化的游离酶有更强的抗逆性、更高的热耐受性和更广的pH适应范围,说明孢子固定化酶的酶学性能得到了改善。虽然固定化导致的糖基化使得CI和SOX分子量均有增加,但并不影响酶的固定和酶学性质。其次,在对最佳孢子固定化菌株的筛选中,利用不同的孢子壁突变株(wt、osw2?、dit1?和chs3?)对以上三种酶分别进行了固定,并对酶学性质进行了研究和比较。研究结果显示,由于osw2?突变株孢子壁最外层二酪氨酸层孔径较大,该菌株不但可以固定大量的目标酶类,而且酶活高于孢子壁完整的wt,差异显著或极显著;与缺失了二酪氨酸层的dit1?菌株相比,osw2?固定化酶虽然Km值较大,但具有较好的抗逆性能、重复利用性能和室温储存性能。综合考虑上述各菌株固定化酶酶学性质,选择osw2?突变株为最佳固定化酶菌株。最后,利用最佳固定化菌株osw2?孢子壁突变菌株,对肌酐降解酶系中的三种酶进行了共固定化的研究,建立了“一孢多酶体系”的孢子共固定化酶方法。其中,在“一孢两酶法”的研究中,实现了CA和CI在osw2?孢子中的共固定化,以肌酐为底物,产生尿素的量是单酶固定化孢子最佳重量配比的2倍;在“一孢三酶法”的研究中,实现了CA、CI和SOX三种酶在osw2?孢子中的共固定化,且展现出良好的酶学性质和室温储存性能;通过对检测体系的优化,可检测的最低肌酐浓度为0.1 mmol·L-1,使得检测灵敏度比单酶固定化提高了50倍,肌酐检测的线性范围为0.1~50 mmol·L-1。由于该检测结果十分接近临床对肾脏病的判断值,论文最后利用酶标仪对高通量样品的检测进行了初探。无需低温储存、可进行高通量检测的肌酐检测体系基本完成。