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目的: 本研究主要观察不同浓度的1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)作用于PC12细胞,随着时间的推移,PC12细胞生存率的变化趋势,观察PC12细胞的一种突触蛋白即突触素(synaptophysin)表达变化。本研究旨在建立与帕金森病相关的细胞损伤模型,为帕金森病的进一步研究提供基础实验依据。 方法: 1、PC12细胞培养和传代:将PC12细胞培养在玻璃培养瓶中,加入DMEM培养基,置于50mL/LCO2孵箱37℃湿化培养,每2天换液一次,当细胞铺满85%-90%瓶底时,0.25%胰酶消化,按1∶3传代,备用。 2、MTT(噻唑蓝)法检测细胞生存率:按MPP+作用时间不同将PC12细胞随机分为5组:A-E组:即MPP+(0h)组~MPP+(96h)组,每组分别培养在不同96孔板中。每组依据MPP+浓度又分为6个亚组(0.1mmol/L、0.3mmol/L、0.5mmol/L、0.7mmol/L、对照组、空白组),每个亚组设6个孔,分别孵0h、24h、48h、72h、96h,对照组加入等剂量PBS溶液,空白组用来调零。 3、细胞免疫荧光法检测突触素蛋白表达:实验分组:将PC12细胞培养在6孔培养板中,随机分为6组:A-E组:即MPP+(0h)组~MPP+(96h)组:每孔加入0.3mmol/LMPP+,分别孵0h、24h、48h、72h、96h;F组:即对照组:每孔加入等剂量PBS溶液。免疫荧光染色检测突触素表达。 4、数据处理与分析:应用MetaMorph/DP10/BX41显微图像分析系统分析免疫荧光强度A(吸收度),使用SPSS19.0统计分析软件进行方差分析。 结果: 1、MPP+对PC12细胞增殖具有明显的抑制作用。对照组细胞接种以后随着时间的延长,吸光度值明显增加,细胞迅速生长,细胞数量明显高于给药组。MPP+组:细胞生存率呈时间-剂量-效应关系。同一浓度MPP+组,随着时间延长,细胞生存率逐渐下降,以0.7mmol/LMPP+组下降最明显。同一时间点,随着MPP+组浓度逐渐增高,细胞生存率逐渐下降。 2、对照组PC12细胞SYN表达阳性,免疫荧光强度值较高;MPP+组(0.3mmol/L)随着时间的延长,SYN免疫荧光强度值呈时间依赖性下降,各时间点与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论: 1、一定浓度范围MPP+对PC12细胞增殖具有明显的抑制作用,它作用于PC12细胞后,可引起PC12细胞的细胞生存率呈时间-剂量依赖性下降,我们可用此药诱导PC12细胞,建立与帕金森病相关的细胞凋亡模型。 2、一定浓度(0.3mmol/L)MPP+可以引起PC12细胞的突触素(SYN)表达减少,呈时间依赖性下降。MPP+可以使PC12细胞突触囊泡转运能力下降,神经递质释放受到抑制,突触前膜胞吞/胞吐过程受阻,损伤突触的形成,导致神经细胞间信息的传递、加工和储存出现障碍。