一.研究背景 帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)是一种常见于中老年人的中枢神经系统变性疾病，主要病理改变为黑质—纹状体多巴胺能神经元进行性变性、死亡，同时伴随残存神经元内出现嗜酸性包涵体(路易小体，Lewy小体)，纹状体多巴胺含量降低。α-突触共核蛋白(α-synuclein)聚集形成的不溶性纤维积聚物，是构成路易小体(帕金森病主要病理特征)主要成份；并且随着对帕金森病的深入研究，在其病因及发病机制方面已取得了很大的进展。越来越多的证据显示，可溶性α-synuclein向异常纤维状的α-synuclein转化是帕金森病发病机制的关键环节，是帕金森病各种诱发因素的共同通路。 研究表明，在基因突变及环境因素协同作用下，多巴胺能细胞内α-synuclein发生错误折叠和聚集，导致细胞内多巴胺浓度提高，进而引起氧化应激反应。α-synuclein的聚集亦能影响泛素-蛋白酶体系统对其降解，进一步造成大量的α-synuclein的聚集并形成细胞内包涵体，影响细胞正常功能及代谢，从而引起细胞死亡，导致帕金森病。 目前帕金森病新的治疗方法有外科手术、脑深部电极高频刺激、基因治疗、神经干细胞移植等，但疗效均未有很大突破，大多数病人仍需药物治疗。外源性左旋多巴是最有效的抗帕金森病药物，但只能控制症状而无法阻止疾病的进展，并且长期使用左旋多巴会引起一些症状波动、运动障碍和精神异常等并发症，其中尤其是开—关现象、异动症等并发症使患者及其家属产生畏惧感。因此，寻找一种能够阻止疾病进展的药物，将为帕金森病的治疗带来新的希望。 利福平(rifampicin，RFP)是半合成利福霉素的衍生物，为广谱抗生素，是诺卡氏菌的发酵产物，在临床应用已久，为抗结核的主要药物之一。另可用于麻风病治疗，并且随着药理学和药效学研究的深入开展，利福平的应用己越来越广泛。 流行病学研究显示，服用抗麻风病药物利福平或氨苯砜几年的麻风病人，其老年性痴呆的患病率明显减低，推测抗麻风药物可能有抑制β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)聚集的作用。并有大量研究表明利福平有抑制β淀粉样蛋白聚集的作用，但具体的机制仍不清楚，推测利福平可能作为一种自由基清除剂起作用。由α-synuclein及其碎片聚集形成的病理性包涵体除存在于帕金森病外，还存在于老年性痴呆患者的老年斑中，而且α-synuclein与β-淀粉样蛋白共同的结构特点以及它们之间的相互作用，提示了帕金森病和老年性痴呆病理过程的相似性。另据美国加州大学生化部的生化物理实验研究结果显示，抗生素利福平以浓度依赖的形式抑制α-synuclein纤维形成，使其现有的纤维解聚。该研究的结果是令人兴奋的，因为阻止了α-synuclein的聚集，就有可能阻止帕金森病的进展，而使已经聚集的α-synuclein纤维解聚，甚至有可能使疾病逆转。但目前国内外尚未见到利用细胞和动物模型来验证这一结论。我们利用1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)诱导PC12细胞大量表达α-synuclein，并产生聚集，观察利福平抑制α-synuclein聚集的作用，为进一步动物实验及其应用于帕金森病的临床治疗提供初步实验依据。 二.研究目的 1.构建大量表达α-synuclein并产生聚集的帕金森病细胞模型。 2.明确利福平对帕金森病细胞模型有保护作用。 3.探讨利福平具有抑制α-synuclein聚集的作用。 4.为进一步动物实验及应用于帕金森病的临床治疗提供依据。 三.实验对象和方法 1.细胞株 PC12：大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞株。 2.细胞培养及药物处理 PC12细胞置于DMEM/F12培养基中进行培养，每隔48h换培养液，当单层培养细胞汇合以后，传代培养。将PC12细胞传入96或6孔培养板中，待细胞进入对数生长期后加药，加入不同剂量的利福平，利福平溶解于甲醇中，使终浓度分别达到0、100、200、300μmol/L，2h后分别加入MPP+，终浓度为1mmol/L，以上剂量用于所有实验。 实验分为6个组：(1)正常对照组；(2)0μmol/L利福平&MPP+(MPP+组)；(3)100μmol/L利福平&MPP+；(4)200μmol/L利福平&MPP+；(5)300μmol/L利福平&MPP+；(6)等体积甲醇&MPP+组六组。 3.研究方法 (1)四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测 干预48h后每孔加入20μlMTT，37℃、5％CO2培养箱内培养4h，弃液，每孔加入150μlDMSO，振荡仪振荡10min，至晶体颗粒溶解，在酶标仪上测定595nm的吸光度。 (2)WesternBlot免疫印记检测α-synuclein的表达 干预48h后，细胞裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白；BCA-100蛋白质定量测定试剂盒测定样品总蛋白含量；每泳道加总蛋白20μg进行SDS-PAGE凝胶电泳后电转移至硝酸纤维素膜上，封闭液封闭3h，一抗孵育4℃孵育过夜，与辣根过氧化物酶标记二抗室温下孵育1h，X线胶片曝光1～10min，显影、定影，图像分析处理。 (3)流式细胞仪检测细胞凋亡 PC12细胞接种于6孔培养板中，培养48h后干预处理，继续培养48h后PBS漂洗，加入AnnexinV-FITC和PI染液重悬细胞，室温避光温育10分钟，HEPES洗涤后过滤上机检测，分析结果。 4.统计学处理 结果以均数±标准差表示。两组间均数比较采用两独立样本的t检验，多组间比较采用单因素方差分析。数据采用SPSS10.0统计软件包分析，P＜0.05表示有统计学差异。 四.实验结果 1.MTT检测细胞活性显示 MTT比色法检测各组细胞活性结果显示，MPP+处理组细胞存活率为76.6％±6.4％，甲醇&MPP+组细胞存活率为71.2％±9.9％，较对照组细胞活性明显下降，而利福平(100、200、300μmol/L)&MPP+处理组细胞存活率分别为91.9％±7.9％、99.8％±8.0％、100.1％±9.1％，利福平&MPP+各组较MPP+处理组细胞活性明显增加，并呈量效依赖关系。统计学分析MPP+处理组与空白对照组比较，P＜0.01有统计学差异；利福平&MPP+各组与MPP+处理组比较，P＜0.05，有统计学差异，甲醇&MPP+组与MPP+组无差异。 2.Westernblot免疫印记检测α-synuclein显示 免疫印记结果显示，MPP+促进α-synuclein的表达并聚集形成三聚体，随着利福平的药物浓度增大，α-synuclein三聚体蛋白的表达减少，而甲醇&MPP+组与MPP+组无差异。 3.流式细胞仪检测凋亡结果显示 流式细胞凋亡检测结果，空白对照组、MPP+处理组、甲醇&MPP+组及利福平(100、200、300μmol/L)&MPP+各浓度组的细胞凋亡率分别为10.63％±0.98％、67.35％±1.72％、74.74％±1.85％、63.45％±1.24％、27.01％±2.74、％22.35％±2.9％；结果显示MPP+组及甲醇&MPP+组的细胞凋亡率明显高于空白对照组，而利福平&MPP+各组随着利福平的浓度增加，细胞凋亡率明显下降，利福平&MPP+各浓度组与MPP+组比较，P＜0.05，差异有统计学意义。 五.结论 1.MPP+对细胞具有毒性作用，引起细胞凋亡，并诱导PC12大量表达α-synuclein并聚集。 2.利福平可以阻断MPP+诱导的PC12细胞凋亡。 3.利福平能够抑制α-synuclein的表达及聚集。