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果实色泽是果实品质的重要指标之一，红梨果实色泽的形成主要依赖于果皮中花青苷的积累。花青苷的积累受到各种环境因素的影响，其中光是影响植物花青苷合成的重要外界环境因素之一。光对花青苷合成的影响包括光质、光强等方面，其中不同光质对植物花青苷积累的影响各异。不同光质通过它们特有的光信号转导通路调控花青苷的生物合成。虽然光信号通路的研究在模式植物拟南芥中已经较为明确，但是在梨等木本植物中并未进行深入研究，且光调控红梨花青苷合成的分子机理也有待研究。本研究以种间杂交品种‘早酥’的红色芽变‘红早酥’梨为研究对象，研究了不同光质对红梨着色的影响以及光调控红梨着色的分子机理。主要研究结果如下：
1）基本明确了蓝光促进花青苷合成的效应，并对红梨中蓝光信号通路重要蛋白进行了克隆分析。利用红光和蓝光采后处理离体‘红早酥’梨果实，确定蓝光促进‘红早酥’梨果皮花青苷积累的作用。通过qPCR分析发现在处理过程中，PpPAL，PpCHS，PpUFGT和PpMYB10等基因表达明显受到蓝光诱导而不受红光诱导，但PpbHLH3,PpbHLH33和PpWD40等基因的表达在不同光质处理间差异不大。我们从‘红早酥’梨中克隆出蓝光受体PpCRY1和PpCRY2以及光信号通路重要基因PpCOP1和PpHY5。qPCR分析显示只有PpHY5的表达受到蓝光调控。通过蛋白互作分析，PpCRY1-PpCOP1，PpCRY2-PpCOP1和PpCOP1-PpHY5之间都存在蛋白互作。进一步研究表明，PpHY5可以结合在PpCHS，PpDFR，PpANS和PpMYB10基因的启动子上并可微弱激活PpCHS的表达。
2）三个BBX蛋白或可作为PpHY5的互作蛋白发挥作用。PpHY5微弱的激活效应与PpCHS，PpMYB10等基因的高表达不符合，据此推测至少存在一个互作蛋白与PpHY5共同发挥作用。为了找到PpHY5的互作蛋白，以PpHY5为诱饵蛋白进行了酵母双杂交筛库试验，发现三个BBX蛋白在筛库结果中多次出现。通过生物信息学分析和生化实验相结合的方式，在梨基因组中一共找到了39个BBX家族蛋白，按照结构域的数量和排布，将其分为五个结构亚组。生信分析显示39个BBX分布于12条染色体和2个Scaffold上且不存在片段复制现象。将筛库得到的可能作为PpHY5的互作蛋白的三个BBX蛋白分别命名为PpBBX16，PpBBX18和PpBBX21。酵母双杂筛库还发现了包括CBXS3，Zinc Finger CCCH domain-containing protein22-like等在内的其他蛋白，这些蛋白也可能作为PpHY5的互作蛋白发挥功能，但是具体机制有待研究。
3）PpBBX16促进花青苷的生物合成。在酵母双杂交筛库及BBX家族分析的基础上，以PpBBX16为研究对象初步验证BBX蛋白调控花青苷合成的功能。生化实验结果表明PpBBX16是具有转录激活能力的转录因子且其表达受到光的诱导。通过异源过表达拟南芥，同源过表达‘茄梨’愈伤组织和瞬时表达梨果实试验证明PpBBX16为花青苷合成的促进因子。进一步研究证明PpBBX16可以促进PpCHS，PpCHI，PpDFR和PpMYB10的基因表达，且PpBBX16发挥功能依赖于PpHY5。上述研究证实了BBX转录因子可为PpHY5的互作蛋白共同调控光诱导的红梨花青苷合成。
4）PpBBX18促进红梨花青苷的生物合成而PpBBX21抑制花青苷的生物合成。为了阐明BBX-HY5复合体调控花青苷合成的分子机制，我们对双杂筛库得到的另外两个BBX蛋白进行了研究。qPCR结果显示PpBBX18与PpBBX21在转录水平上都受到光的诱导。生化实验表明两个蛋白都是具有转录激活效应的转录因子。通过转化拟南芥、‘茄梨’愈伤组织试验以及在‘红早酥’梨果实上进行的瞬时表达试验，证明PpBBX18是花青苷合成途径的促进因子但PpBBX21是花青苷合成途径的抑制因子。PpBBX18通过B-box结构域与PpHY5形成二聚体共同促进PpMYB10的表达。在二聚体中，PpHY5起结合作用而PpBBX18起转录激活作用。进一步研究发现PpBBX21分别通过竞争结合PpBBX18和PpHY5来破坏PpBBX18-PpHY5复合体，从而抑制花青苷合成。本章在分别研究了PpBBX18和PpBBX21调控花青苷合成功能的基础上进一步探究了PpBBX21作为‘减速器’抑制‘PpBBX18-PpHY5’复合体形成的分子机理，表明光诱导花青苷合成是精密且细致的过程。
5）PpBBX18促进花青苷合成网络初步分析。光处理转基因‘茄梨’愈伤组织时发现PpBBX18过表达愈伤组织（PpBBX18-OE组）促进花青苷合成的效果要优于PpBBX16过表达愈伤组织（PpBBX16-OE组），且qPCR结果显示包括PpUFGT，PpMYB10在内的多个花青苷合成基因在PpBBX18-OE组显著高于PpBBX16-OE组。我们利用RNA-Seq分析了两个过表达愈伤组织光/暗处理中的差异表达基因，结果显示PpBBX16与PpBBX21调控的基因网络存在明显差异。进一步分析发现包括ERF，bHLH等在内的转录因子家族的多个成员在PpBBX16-OE组和PpBBX18-OE组存在差异表达。因此，我们推测PpBBX18相较于PpBBX16可能存在不同的调控途径，途径之一则是PpBBX18可能通过促进其他转录因子的表达间接途径调控花青苷的合成。为此，选取了PpBBX18下游而非PpBBX16下游的PpbHLH61-LIKE进行了功能验证，结果显示PpbHLH61-LIKE是花青苷合成的促进因子。本研究初步证明功能类似的BBX蛋白促进花青苷合成的能力存在差异，这种差异或跟BBX下游的调控网络相关。BBX除了可以通过与HY5互作来激活MYB的表达之外还可能通过诱导其他促进因子的表达从而共同促进花青苷的生物合成。
1）基本明确了蓝光促进花青苷合成的效应，并对红梨中蓝光信号通路重要蛋白进行了克隆分析。利用红光和蓝光采后处理离体‘红早酥’梨果实，确定蓝光促进‘红早酥’梨果皮花青苷积累的作用。通过qPCR分析发现在处理过程中，PpPAL，PpCHS，PpUFGT和PpMYB10等基因表达明显受到蓝光诱导而不受红光诱导，但PpbHLH3,PpbHLH33和PpWD40等基因的表达在不同光质处理间差异不大。我们从‘红早酥’梨中克隆出蓝光受体PpCRY1和PpCRY2以及光信号通路重要基因PpCOP1和PpHY5。qPCR分析显示只有PpHY5的表达受到蓝光调控。通过蛋白互作分析，PpCRY1-PpCOP1，PpCRY2-PpCOP1和PpCOP1-PpHY5之间都存在蛋白互作。进一步研究表明，PpHY5可以结合在PpCHS，PpDFR，PpANS和PpMYB10基因的启动子上并可微弱激活PpCHS的表达。
2）三个BBX蛋白或可作为PpHY5的互作蛋白发挥作用。PpHY5微弱的激活效应与PpCHS，PpMYB10等基因的高表达不符合，据此推测至少存在一个互作蛋白与PpHY5共同发挥作用。为了找到PpHY5的互作蛋白，以PpHY5为诱饵蛋白进行了酵母双杂交筛库试验，发现三个BBX蛋白在筛库结果中多次出现。通过生物信息学分析和生化实验相结合的方式，在梨基因组中一共找到了39个BBX家族蛋白，按照结构域的数量和排布，将其分为五个结构亚组。生信分析显示39个BBX分布于12条染色体和2个Scaffold上且不存在片段复制现象。将筛库得到的可能作为PpHY5的互作蛋白的三个BBX蛋白分别命名为PpBBX16，PpBBX18和PpBBX21。酵母双杂筛库还发现了包括CBXS3，Zinc Finger CCCH domain-containing protein22-like等在内的其他蛋白，这些蛋白也可能作为PpHY5的互作蛋白发挥功能，但是具体机制有待研究。
3）PpBBX16促进花青苷的生物合成。在酵母双杂交筛库及BBX家族分析的基础上，以PpBBX16为研究对象初步验证BBX蛋白调控花青苷合成的功能。生化实验结果表明PpBBX16是具有转录激活能力的转录因子且其表达受到光的诱导。通过异源过表达拟南芥，同源过表达‘茄梨’愈伤组织和瞬时表达梨果实试验证明PpBBX16为花青苷合成的促进因子。进一步研究证明PpBBX16可以促进PpCHS，PpCHI，PpDFR和PpMYB10的基因表达，且PpBBX16发挥功能依赖于PpHY5。上述研究证实了BBX转录因子可为PpHY5的互作蛋白共同调控光诱导的红梨花青苷合成。
4）PpBBX18促进红梨花青苷的生物合成而PpBBX21抑制花青苷的生物合成。为了阐明BBX-HY5复合体调控花青苷合成的分子机制，我们对双杂筛库得到的另外两个BBX蛋白进行了研究。qPCR结果显示PpBBX18与PpBBX21在转录水平上都受到光的诱导。生化实验表明两个蛋白都是具有转录激活效应的转录因子。通过转化拟南芥、‘茄梨’愈伤组织试验以及在‘红早酥’梨果实上进行的瞬时表达试验，证明PpBBX18是花青苷合成途径的促进因子但PpBBX21是花青苷合成途径的抑制因子。PpBBX18通过B-box结构域与PpHY5形成二聚体共同促进PpMYB10的表达。在二聚体中，PpHY5起结合作用而PpBBX18起转录激活作用。进一步研究发现PpBBX21分别通过竞争结合PpBBX18和PpHY5来破坏PpBBX18-PpHY5复合体，从而抑制花青苷合成。本章在分别研究了PpBBX18和PpBBX21调控花青苷合成功能的基础上进一步探究了PpBBX21作为‘减速器’抑制‘PpBBX18-PpHY5’复合体形成的分子机理，表明光诱导花青苷合成是精密且细致的过程。
5）PpBBX18促进花青苷合成网络初步分析。光处理转基因‘茄梨’愈伤组织时发现PpBBX18过表达愈伤组织（PpBBX18-OE组）促进花青苷合成的效果要优于PpBBX16过表达愈伤组织（PpBBX16-OE组），且qPCR结果显示包括PpUFGT，PpMYB10在内的多个花青苷合成基因在PpBBX18-OE组显著高于PpBBX16-OE组。我们利用RNA-Seq分析了两个过表达愈伤组织光/暗处理中的差异表达基因，结果显示PpBBX16与PpBBX21调控的基因网络存在明显差异。进一步分析发现包括ERF，bHLH等在内的转录因子家族的多个成员在PpBBX16-OE组和PpBBX18-OE组存在差异表达。因此，我们推测PpBBX18相较于PpBBX16可能存在不同的调控途径，途径之一则是PpBBX18可能通过促进其他转录因子的表达间接途径调控花青苷的合成。为此，选取了PpBBX18下游而非PpBBX16下游的PpbHLH61-LIKE进行了功能验证，结果显示PpbHLH61-LIKE是花青苷合成的促进因子。本研究初步证明功能类似的BBX蛋白促进花青苷合成的能力存在差异，这种差异或跟BBX下游的调控网络相关。BBX除了可以通过与HY5互作来激活MYB的表达之外还可能通过诱导其他促进因子的表达从而共同促进花青苷的生物合成。