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课题研究背景和目的:乳腺癌是一种异质性疾病,根据雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）的表达,以及人表皮生长因子受体2（HER2）的扩增或过表达分为:激素受体阳性（HR+即ER+,PR+）和HER2阴性;HER2阳性（HER2+）;或三阴性（TNBC）即ER-、PR-和HER2-。由于TNBC缺乏激素受体（HR）和HER2治疗靶点,故化疗是三阴乳腺癌治疗主要采用的方法。但是化疗使癌细胞产生多药耐药副作用仍是临床治疗三阴乳腺癌面临的大问题。为了研究三阴乳腺癌在化疗过程中产生耐药的机制,本课题用抗癌药物表柔比星（EPI）筛选出三阴乳腺癌（HS-578T）耐药株,探讨了PI3K/AKT/m TOR信号通路和DNA损伤修复在化疗抵抗中发挥的作用,为耐药机制的研究提供思路和依据。方法:本课题选择人三阴乳腺癌HS-578T细胞株作为实验研究对象,采用本团队筛选耐药细胞专利方法（专利号201410183516.4）,筛选出耐药细胞株HS-578T/EPI（3μg/ml）和HS-578T/EPI（7μg/ml）,进行实验和比较相关检测结果。1、筛选耐药细胞:采取遂步增加表柔比星药物浓度、间歇性诱导三阴乳腺癌细胞HS-578T,使其产生相应浓度耐药性。2、实验分组:耐药细胞HS-578T/EPI（3μg/ml）和HS-578T/EPI（7μg/ml）为两组实验细胞,亲本HS-578T细胞为对照组。3、Western blotting实验:1)检测三组细胞中耐药蛋白ERCC1,P-gp,MRP1,LRP,BCRP表达情况;2)检测三组细胞中PI3K/AKT/m TOR信号通路相关蛋白p-AKT,AKT和p-m TOR,m TOR表达情况;3)用MK2206（AKT抑制剂）预处理细胞24h后,细胞中耐药蛋白ERCC1,P-gp,MRP1,LRP,BCRP表达变化;4)用不同浓度（7μg/ml,3.5μg/ml）表柔比星处理细胞后,检测不同时间段（0h,6h,12h,24h,48h）三组细胞中DNA损伤修复蛋白CHK2和损伤蛋白γ-H2AX的表达变化;5)用MK2206（AKT抑制剂）预处理三组细胞24h后,检测细胞中DNA损伤修复蛋白CHK2和损伤蛋白γ-H2AX的表达变化。4、MTT细胞增殖实验:1)检测三组细胞生长速率;2)检测表柔比星、紫杉醇、顺铂对三组细胞生长抑制率;3)检测细胞用MK2206预处理后,表柔比星、紫杉醇、顺铂对细胞生长抑制率的影响;4)用MK2206预处理三组细胞后,检测细胞的增殖变化,分别计算其抑制率并用Graph Pad 5.0软件计算出IC50。5、克隆形成实验:检测细胞生长速度。6、q PCR实验:1)检测三组细胞中耐药基因ERCC1,P-gp,MRP1,LRP,BCRP表达情况;2)用MK2206（AKT抑制剂）预处理三组细胞24h后,细胞中耐药基因ERCC1,P-gp,MRP1,LRP,BCRP表达变化。7、流式细胞术:检测细胞周期分布。8、彗星实验:1)检测细胞在加入7μg/ml表柔比星处理24h后,细胞DNA损伤情况;2)检测MK2206（AKT抑制剂）预处理细胞24h,再加入7μg/ml表柔比星处理24h后,细胞DNA损伤变化情况。9、形态学观察:光镜下观察细胞形态变化。结果:1、筛选出可以在相应浓度表柔比星培养体系中稳定存活耐药细胞株;2、二组耐药细胞在表柔比星、紫杉醇、顺铂处理后,细胞存活率明显高于HS-578T亲本细胞,且耐药细胞HS-578T/EPI（7μg/ml）较HS-578T/EPI（3μg/ml）细胞在紫杉醇和表柔比星处理后,细胞存活率更高;3、二组耐药细胞与亲本细胞比较,细胞形态上差异大,耐药细胞变得更细长,细胞间的排列较为松散,耐药细胞HS-578T/EPI（7μg/ml）较HS-578T/EPI（3μg/ml）细胞形态变化更明显;4、耐药细胞发生了G1/S期阻滞;与亲本细胞相比,耐药细胞生长速率明显减慢;HS-578T/EPI（7μg/ml）较HS-578T/EPI（3μg/ml）细胞阻滞更明显,生长速率更慢;5、二组耐药细胞中ERCC1,P-gp,MRP1,LRP,BCRP基因和蛋白表达均明显增高;且HS-578T/EPI（7μg/ml）较HS-578T/EPI（3μg/ml）细胞表达增高更明显,呈现浓度依赖性;6、表柔比星作用后,二组耐药细胞与亲本细胞比较,DNA损伤修复蛋白CHK2明显增加,而DNA损伤蛋白γ-H2AX增加较亲本细胞少;彗星尾部较短,显示DNA损伤较少;且耐药细胞HS-578T/EPI（7μg/ml）较HS-578T/EPI（3μg/ml）CHK2增加更明显,γ-H2AX增加更少,彗星尾部更短,显示DNA损伤更少;7、二组耐药细胞较HS-578T细胞,p-AKT/AKT及p-m TOR/m TOR比值增高,且HS-578T/EPI（7μg/ml）细胞表达更高;AKT抑制剂MK2206预处理后,耐药细胞p-AKT/AKT及p-m TOR/m TOR比值减低;耐药蛋白ERCC1,P-gp,MRP1,LRP,BCRP表达减低;耐药基因ERCC1,P-gp,MRP1,LRP,BCRP表达明显减低;8、AKT抑制剂MK2206处理后,HS-578T/EPI（3μg/ml）、HS-578T/EPI（7μg/ml）细胞和HS-578T细胞DNA损伤修复蛋白CHK2表达减低,DNA损伤蛋白γ-H2AX增加。结论:1、成功筛选出表柔比星耐药细胞HS-578T/EPI（3μg/ml）和HS-578T/EPI（7μg/ml）,且具有多药耐药特征;2、耐药细胞较亲本细胞在细胞形态、生长周期、生长速率和DNA损伤修复等表观遗传学方面有明显改变,且HS-578T/EPI（7μg/ml）细胞较HS-578T/EPI（3μg/ml）变化更明显;3、耐药细胞HS-578T/EPI（3μg/ml）和HS-578T/EPI（7μg/ml）耐药性增强可能与PI3K/AKT/m TOR信号通路的激活,进而DNA损伤修复增强有关。