【摘 要】
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恶性肿瘤严重危害人类健康,是最主要的致死疾病之一。化疗是治疗恶性肿瘤的重要手段,但化疗药物的选择性差,会导致全身多器官及组织的毒副作用,严重影响患者的生存质量。因此,寻找高效、低毒的新型抗肿瘤药物十分必要。本实验室从黑根霉（Rhizopus nigricans）发酵液中分离到胞外粗多糖,纯化后得到两种多糖组分,分别命名为EPS1-1和EPS-2,对前者的抗肿瘤活性已经进行了广泛的研究。EPS-2为
【基金项目】
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973项目（2012CB822102）； 安徽省高校自然科学研究重大项目（KJ2021ZD0101）； 安徽省高校自然科学研究重大项目（KJ2018ZD025）； 国家重点研究开发计划（2018YFA0902000）；
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恶性肿瘤严重危害人类健康,是最主要的致死疾病之一。化疗是治疗恶性肿瘤的重要手段,但化疗药物的选择性差,会导致全身多器官及组织的毒副作用,严重影响患者的生存质量。因此,寻找高效、低毒的新型抗肿瘤药物十分必要。本实验室从黑根霉（Rhizopus nigricans）发酵液中分离到胞外粗多糖,纯化后得到两种多糖组分,分别命名为EPS1-1和EPS-2,对前者的抗肿瘤活性已经进行了广泛的研究。EPS-2为混合组分,尚未对其结构和活性进行研究。在本论文中,利用多种柱层析技术从EPS-2中分离纯化出一种单一多糖--EPS2-1,对其理化性质、结构表征和抑制人肺腺癌A549细胞的活性进行了研究。1.黑根霉胞外多糖EPS2-1的分离纯化、结构解析和抗氧化活性利用DEAE-52、Sephadex G-100和G-75对粗多糖进行分离和纯化,得到EPS2-1。高效凝胶渗透色谱法检测其分子量和多分散指数,离子色谱法测定单糖组成,透射电镜和原子力显微镜观察多糖的表观形貌,红外光谱、甲基化实验、核磁共振分析EPS2-1的结构,抗氧化试剂盒检测EPS2-1对三种自由基的清除活性和铁离子还原能力。结果表明,EPS2-1的重均分子量是32803 Da,多分散指数为1.345,EPS2-1中不含淀粉、蛋白质、核酸。EPS2-1主要由甘露糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖和岩藻糖组成,摩尔比例为5.19:2.04:0.65:0.31:0.29。EPS2-1为含支链的线性多糖,主链由→2)-α-D-Manp-（1→和→3）-β-D-Galp-（1→组成。EPS2-1 能够清除 DPPH、ABTS 和羟自由基,并具有一定的铁离子还原能力。2.黑根霉胞外多糖EPS2-1对人肺腺癌A549细胞的抑制作用体外培养人肺腺癌A549细胞,CCK-8法检测细胞存活率,细胞划痕和克隆形成实验检测EPS2-1对细胞迁移、增殖的影响,荧光显微镜或流式细胞仪检测EPS2-1对细胞内活性氧、线粒体膜电位和细胞周期的影响。Hoechst 33258染色和Annexin-FITC/PI双染法检测EPS2-1对细胞凋亡的影响,检测EPS2-1对细胞内Caspase 3、Caspase 8和Caspase 9活性的影响。结果表明EPS2-1可以显著抑制A549细胞增殖,处理48 h后,在0.8 mg/mL时的抑制率为60.29%。EPS2-1能够抑制A549细胞划痕愈合能力,表明其可以抑制细胞迁移:同时,EPS2-1能够抑制细胞克隆形成能力。EPS2-1能够增加细胞内活性氧水平,降低线粒体膜电位;使细胞内核染色质凝集,产生凋亡小体,增加早、晚期凋亡细胞比例。同时,EPS2-1能够提高A549细胞内Caspase 3和Caspase 8的活性,推测EPS2-1通过线粒体途径诱导细胞凋亡。综上所述,本文从黑根霉的发酵液中分离得到分子量为32803 Da的EPS2-1,主链由→2）-α-D-Manp-（1→和→3）-β-D-Galp-(l→组成。EPS2-1能够抑制人肺腺癌A549细胞增殖和迁移,诱导细胞凋亡,值得进一步研究,以开发出治疗或辅助治疗肺癌的药品或功能食品。
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