HIF-1α基因沉默对肾癌细胞A498氧化应激后自噬及凋亡影响的研究

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目的探索肾癌A498细胞系在氧化应激状态下自噬发生的机制及其对细胞凋亡的影响,为探索治疗的新方法提供实验依据和理论基础。方法1.应用不同浓度H2O2以及不同作用时间分别干预A498细胞,通过检测其CCK-8、ROS(活性氧簇)阳性细胞数量,确定构建A498细胞氧化应模型的H2O2最佳作用浓度及时间。选择200 μM为H2O2处理细胞的最适浓度,分别作用A498细胞不同时间后,Western blot检测氧化应激对自噬相关蛋白LC3Ⅱ和p62以及HIF-1α(低氧诱导因子1α)蛋白表达的变化。2.设计并合成一段针对人HIF-1α基因的shRNA,退火连接构建重组载体并酶切鉴定,将重组质粒与病毒包装、包膜质粒共转染293T细胞,收集病毒上清转染A498细胞,嘌呤霉素筛选10 d以上,获得稳定转染的A498 shHIF-1α细胞株,并以不针对人HIF-1α基因的shRNA作为对照。应用Western Blot和qRT-PCR分别在蛋白和mRNA水平鉴定上述细胞株的HIF-1α表达改变。3.分别用200 μM H2O2处理稳定转染HIF-1α基因shRNA细胞株A498 shHIF-1α6h后,检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ和p62表达的变化。应用HIF-1α的特异性抑制剂YC-1(50μM)、抗氧化剂NAC(100mg/ml)分别联合H2O2处理细胞,检测HIF-1α及自噬相关蛋白的表达变化。4.用 200 μM H2O2 分别处理 A498 shcoo2 和 A498 shHIF-1α 6 h、12 h,检测HIF-1α基因沉默对A498细胞凋亡相关蛋白c-PARP的表达变化。5.合成并构建针对人LC3基因shRNA的重组载体,药物筛选获得稳定转染细胞株并鉴定后,用200 μM H2O2分别处理6 h、12 h,检测该细胞株的c-PARP表达水平。分别应用细胞自噬抑制剂3-MA、自噬诱导剂Rapa预处理细胞后,观察A498细胞凋亡相关蛋白的表达变化。6.采用spss17.0软件对检测结果进行统计学分析,采用重复测量资料的方差分析进行多时间点的结果比较,采用单因素方差分析进行单个时间点的检测结果分析。结果10采用 50、100、150、200、300、400μMH2O2 处理 A498 细胞 12h 后,分别使细胞活性降低了 23.9%、58.5%、72.8%、86.7%、96.6%、97.7%。应用 200 μM H2O2 作用细胞 2 h、4 h、8 h 后,其 ROS 细胞分别为 19.8%、32.6%、35.5%、83.8%,综合结果认为,200 μMH2O2是本实验的最佳作用浓度。2.200 μM H2O2分别作用A498细胞2 h、4 h、8 h后,细胞自噬蛋白LC3Ⅱ和p62分别比未处理前增加了 2.1、3.7、4.5倍和降低了 23.4%、30.1%、52.3%,细胞内HIF-1α蛋白的表达水平也分别增加了 44.5%、93.3%、140%。3.成功构建针对人HIF-1α基因的稳定细胞株A498 shHIF-1α后,与未处理前相比,经H2O2作用6 h后,对照组和实验组的LC3Ⅱ分别增加了 1.06倍和1.03倍,且实验组的LC3Ⅱ增加量比对照组要低19.4%(p=0.035);同时对照组和实验组的p62分别降低了 25.0%和13.8%,且实验组p62蛋白表达水平的降低量比对照组要高72.8%(p=0.027)。4.NAC预处理A498 shHIF-1α细胞后,H2O2单独处理组与二者联合处理组相比,单独处理组p62减少了 38.7%(p<0.0001),但是LC3 Ⅱ与HIF-1 α变化不明显。YC-1预处理之后再用H2O处理与单独H2O2处理相比,p62表达增高了 18.7%,LC3Ⅱ表达降低并17.4%,HIF-1α表达降低了 5.8%(p值均<0.05)。5.经HIF-1α基因沉默,H2O2分别作用细胞6h、12h后,与对照组相比c-PARP的表达量明显下降了 36.2%、21.0%(p=0.028)。6.人LC3基因沉默后,H2O2分别处理6h和12h,与对照组相比细胞凋亡相关蛋白c-PARP表达水平显著升高(分别增加了 7.3、14.2倍,p=0.034)。且3-MA、Rapa预处理细胞后再加H2O2干预,与H2O2单独处理组相比,3-MA与H2O2联合处理的c-PARP表达量下降了 62.1%(p<0.0001),而Rapa与H2O2联合处理增加了 92.6%(p<0.0001),Rapa 与 H2O2联合处理组的 c-PARP 是 3-MA 与 H2O2联合处理的4倍(p<0.0001)。结论1.200 μMH2O2处理A498细胞后,能够以时间依赖的方式诱导细胞发生自噬及HIF-1α表达升高。2.HIF-1α基因沉默之后,A498细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达下降,而p62水平升高;YC-1通过特异性抑制HIF-1α使自噬受到了抑制,而NAC通过降低ROS部分抑制A498细胞自噬反应。进一步表明HIF-1α与细胞自噬密切相关。3.H2O2诱导的氧化应激能够引起A498细胞发生凋亡,但HIF-1α基因沉默后,细胞凋亡显著减轻。通过抑制LC3基因,氧化应激引起的A498细胞凋亡减轻,表明氧化应激诱导A498细胞产生的自噬作用是促进细胞凋亡的。
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