类胡萝卜素在生物体内具有重要的生理功能,其中虾青素的抗氧化活性、提高动物的免疫能力,预防癌症等生理功能更为显著。类胡萝卜素的代谢工程在大肠杆菌、酵母和高等植物中已取得了较大的进展。本文对真核微藻类胡萝卜素代谢工程进行了初步的探索。1.克隆雨生红球藻β-胡萝卜素羟化酶基因crtR-B,基因枪法转入衣藻叶绿体,经强光处理转化子,HPLC分析表明细胞的叶黄素库(V+A+Z)量较野生型增加,表明是外源的β-胡萝卜素羟化酶将β-胡萝卜素生成玉米黄素。2.克隆雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因bkt,基因枪法转入衣藻叶绿体,RT-PCR及RT-PCR Southern blot分析表明外源基因具有转录活性,但未检测到转化子中积累虾青素。3.根据盐生杜氏藻大量积累β-胡萝卜素的特点,对其遗传转化体系进行了研究。发现20μg/ml草丁膦Basta,能够完全抑制1.0×10~6个/ml细胞生长;通过GUS报告基因在细胞内的瞬时表达,确立了轰击压力450 psi、距离6 cm为基因枪法转化盐生杜氏藻的最佳条件;将bar基因转入细胞,得到稳定的转化子,初步建立了盐生杜氏藻稳定遗传转化体系。克隆了盐生杜氏藻八氢番茄红素合成酶基因psy的cDNA序列、基因组序列及psy基因上游459 bp片段。本文首次开展了衣藻类胡萝卜素代谢工程研究,发现在强光处理下,衣藻crtR-B转化子外源的羟化酶作用使叶黄素库量增加,实现了对衣藻类胡萝卜素代谢途径的修饰。确立了bar基因为选择标记、Basta为筛选试剂的基因枪转化盐生杜氏藻的遗传转化体系,并克隆了其内源的psy基因5’上游序列,为通过基因工程手段在盐生杜氏藻细胞内积累虾青素奠定了基础。