背景:高血压病是中老年人常见的全身系统性疾病,持续高血压会引起的眼部视网膜血管的损伤导致高血压视网膜病变的形成。这一眼部并发症占高血压病人群的百分之七十,近年来引起了越来越多的关注。高血压视网膜病变主要通过影响视网膜血管病理变化引起视网膜病理生理改变,其主要临床特征包括视网膜动脉变细反光增强、动静脉比例减小、动静脉交叉压迫征、出血、棉絮斑、严重者出现视神经视盘水肿及动脉硬化的各种并发症。泛素-蛋白酶体系统是真核细胞内重要的蛋白质降解系统之一,参与调节细胞周期、基因转录、抗原呈递、细胞增殖与分化以及信号转导等多种生理过程。泛素-蛋白酶体系统由泛素、泛素活化酶、泛素连接酶、泛素蛋白连接酶、26S蛋白酶体和去泛素化酶组成。泛素-蛋白酶体降解蛋白是一种级联反应过程。完成泛素化的蛋白质最终被20S蛋白酶体所降解。免疫蛋白酶体是一种由标准蛋白酶体衍生的高效的蛋白水解机制,在各类炎症性疾病的发病机制中起着至关重要的作用。20S免疫蛋白酶体包含三个β功能亚单位(也被称为免疫蛋白酶体亚基),包括β1i(LMP2和PSMB9)表达半胱氨酸蛋白酶活性,β2i(LMP10,PSMB10或mecl-1)表达胰蛋白酶活性和β5i(LMP7或PSMB8)表达糜蛋白酶活性,研究证明免疫蛋白酶体具有更广泛的生物学功能。在血管紧张素II或高盐刺激引起的系统性高血压病变模型中,LMP 10和LMP 7两种免疫蛋白亚基在心脏组织中表达增加,高盐诱导高血压模型LMP 10敲除对小鼠心脏重构具有抑制作用。此外,视网膜病变组织中免疫蛋白酶体亚基的表达和活性也明显增加。抑制免疫蛋白酶体的活性能够改善疾病的发生。然而,LMP 10在视网膜病变中的作用机制研究甚少,在血管紧张素II诱导的高血压视网膜病变模型中的作用尚不清楚。本研究通过建立血管紧张素II诱导的高血压视网膜病变模型,采用野生型、LMP10基因敲除以及LMP10基因过表达三种不同小鼠,观察在基因敲除/过表达或应用IKKβ抑制剂的作用下不同模型的视网膜病理生理变化,旨在阐述LMP10在高血压视网膜病变中的作用机制,进一步探索LMP10通过降解PTEN和IKBα降低炎症相关通路反应从而改善视网膜病变的病理生理过程。目的:1.建立血管紧张素II诱导的高血压视网膜病变野生小鼠模型,观察小鼠视网膜及外周血清中蛋白酶体亚基LMP10及胰蛋白酶活性水平,在临床高血压视网膜病变患者外周血清中检测LMP10水平,明确LMP10在高血压视网膜病变患者及鼠模型中的表达变化。2.应用LMP10基因敲除鼠建立血管紧张素II诱导的高血压视网膜病变模型,观察野生/基因敲除鼠视网膜病理表型变化,探讨LMP10对高血压小鼠视网膜形态学、炎症、血管通透性改变、氧化应激的影响,从分子水平阐述LMP10在高血压视网膜病变中的作用机制。3.应用腺相关病毒构建眼内LMP10过表达小鼠,观察该鼠模型在血管紧张素II诱导下视网膜形态学、血管通透性改变、炎症及氧化应激的病理改变,进一步探讨LMP10在高血压视网膜病变中的分子机制4.应用IKKβ特异性抑制剂IMD-0354作用于LMP10过表达/GFP空白对照小鼠,观察阻断NF-κB相关炎症通路后不同组小鼠的视网膜病变情况,阐述LMP10及IMD-0354对PTEN/AKT/IKK通路的作用机制,讨论降低LMP10或应用IKK抑制剂能够改善由血管紧张素II诱导的高血压视网膜病变的分子机制。方法:1.高血压视网膜病变小鼠模型建立:应用血管紧张素II(3000ng/kg/min)缓释泵灌注C57BL/6野生型小鼠,LMP10基因敲除小鼠3周诱导视网膜病变。给小鼠眼玻璃体腔注射2型腺相关病毒rAAV2-GFP对照或rAAV2-LMP10过表达LMP10,腹腔内注射IKK抑制剂IMD-0354预处理小鼠。2.临床资料和血清收集。包括健康人、高血压患者(不合并高血压视网膜病变)和高血压视网膜病变患者一般情况、病例资料、眼科检查及眼底照相、血清标本。使用酶联免疫吸附法测定血清标本LMP10含量,蛋白酶体活性试剂盒检测胰蛋白酶活性。3.视网膜病理观察:应用眼底血管造影系统观察小鼠视网膜血管整体情况;应用石蜡切片HE染色法、免疫组织化学方法、冰冻切片免疫荧光技术观察视网膜形态学、血管通透性、血管内皮细胞增殖、炎症及氧化应激反应。4.应用蛋白质免疫印迹法(Western-blot)检测LMP10,PTEN,p-AKT,AKT,p-IKKα/β,IKKβ,p-Ik Bα,IkBα,p-p65和p65蛋白水平。结果:1.在血管紧张素II(3000ng/kg/min,3周)诱导下,小鼠收缩压显著性升高。免疫蛋白酶体亚基LMP10及其胰蛋白酶活性在血管紧张素II诱导的高血压视网膜病变模型鼠的视网膜和血清,以及高血压视网膜病变患者的血清中表达增加。2.LMP10缺乏能够改善由血管紧张素II诱导视网膜形态学改变、血管通透性增加、炎症反应加重及氧化应激的损伤。(1)HE染色显示血管紧张素II诱导的野生型小鼠视网膜较盐水组厚度增加,LMP10基因敲除小鼠视网膜厚度较野生型小鼠减少,差异具有统计性意义。(2)视网膜血管造影显示血管紧张素II诱导的高血压野生型小鼠视网膜动脉血管变细,小动脉狭窄,可见荧光弥散及渗漏,提示视网膜血管损伤,通透性增加。在LMP10敲除的高血压小鼠模型中,这一病理改变减轻。凝集素B4(Isolectin B4)免疫荧光染色显示血管紧张素II诱导的野生型小鼠视网膜血管内皮细胞增殖,LMP10敲除减轻了内皮细胞的增殖现象。此外,血管内皮细胞生长因子VEGF的蛋白水平变化也与视网膜血管通透性增加相关,且水平变化趋势具有一致性。(3)二氢乙锭(超氧化物阴离子荧光探针,DHE)染色显示血管紧张素II诱导的小鼠视网膜ROS活性氧增加,提示氧化应激反应的激活,在LMP10敲除小鼠视网膜氧化应激程度减轻。同时视网膜氧化应激NOX1和NOX4亚基mRNA水平的检测支持这一现象。(4)Iba1(小胶质细胞/巨噬细胞特异性蛋白抗体)免疫组织化学染色显示在血管紧张素II诱导的野生型小鼠视网膜中,激活的小胶质细胞及巨噬细胞增加,炎症相关因子IL-1和IL-6 mRNA水平表达上调,LMP10敲除后,视网膜炎症表达减少。3.通过检测PTEN/AKT/NF-κB信号通路蛋白,发现血管紧张素II引起野生型小鼠视网膜p-IKKα/βand p-p65蛋白水平表达增加,LMP10敲除小鼠能够部分逆转这一现象。此外,血管紧张素II引起的IkBa蛋白降低在LMP10敲除的小鼠中得到显著逆转。说明LMP10敲除减少了IKKα/β和IkBa的降解,进一步抑制了NF-k B通路的激活。同时,我们还发现血管紧张素II引起PTEN蛋白水平降低,AKT水平增高,而这一变化在LMP10敲除小鼠视网膜中得到逆转。4.眼内LMP10过表达小鼠模型的建立。玻璃体腔注射2型腺相关病毒(rAAV2)LMP10/GFP两周后冰冻切片显示视网膜腺相关病毒转染良好,与rAAV2-GFP小鼠相比,rAAV2-LMP10小鼠视网膜LMP10蛋白含量升高1.8倍。5.过表达LMP10能够加重血管紧张素II诱导的视网膜形态学改变、血管通透性增加、炎症反应激活及氧化应激的损伤。在3周血管紧张素II的诱导下,rAAV2-GFP小鼠中央视网膜厚度增加,视网膜血管通透性增加、管腔变窄、血管内皮细胞增殖,VEGF蛋白及mRNA水平增高,这些病理改变在rAAV2-LMP10小鼠视网膜中表现更加明显。同时血管紧张素II诱导视网膜氧化应激及炎症损伤,NOX1、NOX4、IL-1、IL-6 mRNA表达增加,这些改变在rAAV2-LMP10小鼠视网膜中更加突出。6.血管紧张素II诱导的rAAV2-GFP小鼠视网膜PTEN和IkBa蛋白表达减少,LMP10过表达使这两种蛋白表达进一步减少。同时LMP10的过表达使血管紧张素II诱导增多的AKT,IKKα/β和p65磷酸化水平进一步增加。7.腹腔注射IKKβ抑制剂IMD-0354能够有效缓解由血管紧张素II引起的中央视网膜厚度的增加,视网膜血管通透性的增加及VEGF mRNA及蛋白表达水平的提高。同时,IMD-0354的应用能够降低由血管紧张素II引起的氧化应激反应,抑制视网膜小胶质/巨噬细胞的激活及减少NOX1、NOX4、IL-1、IL-6 mRNA表达量。8.蛋白水平检测发现应用IMD-0354不能影响PTEN水平及AKT磷酸化程度。在血管紧张素II诱导下的rAAV2-LMP10或rAAV2-GFP小鼠视网膜组织中,IMD-0354能够显著抑制IKKα/β,IkBa和p65的磷酸化。应用IMD-0354能够逆转由血管紧张素II诱导的Ik Ba蛋白水平的降低。结论:1.免疫蛋白酶体亚基LMP10及其胰蛋白酶活性在血管紧张素II诱导的高血压视网膜病变模型鼠的视网膜和血清,以及高血压视网膜病变患者的血清中表达增加。2.LMP10缺乏能够改善由血管紧张素II诱导视网膜形态学改变、血管通透性增加、炎症反应加重及氧化应激的损伤。LMP10基因过表达能够加重血管紧张素II诱导的视网膜形态学改变、血管通透性增加、炎症反应激活及氧化应激的损伤。3.LMP10在高血压视网膜病变分子机制中具有重要作用,应用LMP10特异性抑制剂可能成为治疗高血压视网膜病变的新靶点。4.应用IKKβ抑制剂IMD-0354能够有效缓解由血管紧张素II引起的中央视网膜增厚、血管通透性的增加、炎症反应及氧化应激。IMD-0354可能通过抑制炎症通路参与高血压视网膜病变的病理生理过程。