铁皮石斛(兰科草本植物Dendrobium officinale Kimura et Migo的干燥茎),主要分布于浙江、广州和云南等地,是一种传统名贵中药材,具有生津益胃、滋阴清热以及润肺益肾等功效,在民间,被誉为“救命仙草”和药界的“大熊猫”。铁皮石斛多糖(Dendrobium officinale polysaccharide,DOP)是铁皮石斛的主要生物活性成分之一,具有显著的药理活性,包括抗氧化、抗病毒、抗炎、抗衰老、降血糖及免疫调节等活性。本课题组近年来致力于铁皮石斛多糖的提取分离纯化方法及相关生物活性的研究。前期研究发现,铁皮石斛多糖可有效缓解2型糖尿病(T2DM)小鼠的糖代谢紊乱,其降糖作用机制可能与胰岛素介导的PI3K/Akt信号通路有关。然而,目前已有文献从分子水平探讨铁皮石斛多糖降糖作用机制的研究主要集中于胰岛素途径,机制单一,研究并不充分。因此,进一步探讨其降糖作用机制变得尤其重要。本课题拟沿用课题组前期已确立的成熟提取工艺,从浙江乐清铁皮石斛干燥茎中提取分离纯化铁皮石斛多糖。体内实验以高脂高糖饲料(HFD)联合链脲佐菌素(STZ)建立的T2DM模型为研究对象;体外实验以高糖诱导的胰岛素抵抗HepG2细胞模型为研究对象;旨在全面系统地研究铁皮石斛多糖对2型糖尿病小鼠高血糖症的缓解作用及其作用机制,完善其分子机制网络,为铁皮石斛多糖的进一步开发利用提供研究基础。第一部分铁皮石斛多糖的提取分离、纯化及鉴定采用水提醇沉法从浙江乐清铁皮石斛干燥茎中得到铁皮石斛多糖水提液;水提液经醇沉、干燥得到铁皮石斛粗多糖;再将铁皮石斛粗多糖经反复冻融后,超滤、冻干,最终得到水溶性棉花絮状精制铁皮石斛多糖DOP。苯酚-硫酸法、HPGPC法及紫外扫描法结果显示,铁皮石斛多糖的糖含量为99.36%、重均分子量为190 kDa、几乎不含蛋白质和核酸。同时HPLC法测定铁皮石斛多糖的单糖组成为甘露糖:葡萄糖=4.41:1.00。该部分实验提取纯化的铁皮石斛多糖性状产率稳定、分子量均一、纯度高,满足后续药理学研究的要求。第二部分铁皮石斛多糖缓解2型糖尿病小鼠高血糖症的作用研究高脂高糖饲料喂养C57BL/6小鼠8周并联合小剂量多次腹腔注射STZ成功诱导建立T2DM模型(以空腹血糖水平FBG≥11.1mmol/L为标准),之后给予低、中、高剂量的铁皮石斛多糖治疗4周。给药期间定期观察各组小鼠的精神活动状态,并记录各组小鼠的空腹血糖FBG和体重;处死各组小鼠前进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT);解剖后检测各组小鼠血清胰高血糖素水平;制作肝脏组织和胰腺组织H&E染色切片。实验结果显示,给予铁皮石斛多糖4周后,低、中、高剂量给药组小鼠活动状态好转,体重有所升高,高血糖症也得到明显改善。同时,预防给药组小鼠血糖水平也较模型对照组显著性降低,表明铁皮石斛多糖对2型糖尿病小鼠高血糖症的发生有一定的预防作用。OGTT实验结果表明铁皮石斛多糖能够显著提高2型糖尿病小鼠对葡萄糖的耐受力,修复受损的糖耐量。而且,铁皮石斛多糖给药组小鼠血清胰高血糖素水平较模型对照组小鼠显著性下降,表明铁皮石斛多糖能够抑制2型糖尿病小鼠胰高血糖素的分泌,缓解2型糖尿病小鼠的高血糖症。此外,H&E染色切片显示铁皮石斛多糖能够显著改善2型糖尿病小鼠肝脏的脂肪变性及胰腺损伤现象。本实验结果证实铁皮石斛多糖可以降低2型糖尿病小鼠的空腹血糖水平、提高葡萄糖耐受力、降低血清胰高血糖素水平以及改善肝脏脂肪变性和胰腺损伤,缓解2型糖尿病小鼠的高血糖症。第三部分铁皮石斛多糖缓解2型糖尿病小鼠高血糖症的机制研究给予铁皮石斛多糖结束后,解剖小鼠,分离肝脏,制作肝脏PAS染色切片,观察肝糖原的分布情况;同时采用生化法检测小鼠肝糖原含量。实验结果表明,铁皮石斛多糖能够显著提高2型糖尿病小鼠的肝糖原含量。与此同时,从肝糖原代谢和肝糖异生两大方面探讨铁皮石斛多糖缓解2型糖尿病小鼠高血糖症的分子机制。采用Western blot法检测小鼠肝糖原代谢相关酶GS、p-GS、PYGL和GBE及cAMP-PKA信号通路相关蛋白Glucagon、GCGR、AC、PKA-C和p-PKA的蛋白表达水平,结果显示铁皮石斛多糖可通过下调2型糖尿病小鼠肝脏cAMP-PKA信号通路相关蛋白的表达量,调节肝糖原代谢相关酶的表达,表明铁皮石斛多糖能够抑制2型糖尿病小鼠cAMP-PKA信号通路,调节肝糖原代谢,从而发挥缓解2型糖尿病小鼠高血糖症的作用。此外,采用Western blot法检测小鼠肝糖异生相关酶PEPCK和G6Pase及Akt/FoxO1信号通路相关蛋白Akt、p-Akt、FoxO1和p-FoxO1的蛋白表达水平,结果显示铁皮石斛多糖能够上调2型糖尿病小鼠肝脏p-Akt及p-FoxO1蛋白的表达量,下调肝糖异生酶PEPCK和G6Pase的表达,表明铁皮石斛多糖能够刺激2型糖尿病小鼠Akt/FoxO1信号通路,抑制肝糖异生,从而缓解2型糖尿病小鼠高血糖症。本部分实验证明铁皮石斛多糖能够影响2型糖尿病小鼠肝脏由胰高血糖素介导的cAMP-PKA和Akt/FoxO1两条信号通路,促进肝糖原合成,抑制肝糖原分解以及肝糖异生,从而改善肝糖代谢,缓解2型糖尿病小鼠的高血糖症。第四部分体外探讨铁皮石斛多糖通过抑制cAMP-PKA信号通路对肝糖原代谢的调控作用为了验证铁皮石斛多糖能够通过抑制cAMP-PKA信号通路调控肝糖原代谢从而缓解2型糖尿病小鼠高血糖症这一机制,本部分实验建立了高糖诱导的胰岛素抵抗HepG2细胞模型,并用铁皮石斛多糖干预培养24 h。采用Western blot法检测HepG2细胞中肝糖原代谢相关酶GS、p-GS、PYGL和GBE及cAMP-PKA信号通路相关蛋白Glucagon、GCGR、AC、PKA-C和p-PKA的蛋白表达水平,体外实验结果与体内实验结果一致。表明,铁皮石斛多糖能够抑制高糖诱导的胰岛素抵抗HepG2细胞cAMP-PKA信号通路,调节肝糖原代谢。为进一步确定铁皮石斛多糖对cAMP-PKA信号通路的抑制作用,我们在细胞实验中加入了腺苷酸环化酶(AC)激活剂。结果显示铁皮石斛多糖干预培养24 h后,HepG2细胞中cAMP-PKA信号通路相关蛋白的表达量均显著下调,而AC激活剂可补偿铁皮石斛多糖的这一作用,再次证实铁皮石斛多糖能够抑制cAMP-PKA信号通路。第五部分铁皮石斛多糖对2型糖尿病小鼠肝糖原分子结构的影响采用温和的肝糖原提取方法从各组小鼠的肝脏组织中提取出肝糖原,再将其纯化、冻干,最终得到白色水溶性棉花絮状肝糖原。采用分子体积排阻色谱(SEC)对肝糖原分子结构进行分析,结果显示正常组小鼠的肝糖原分子结构具有一定的稳定性,DMSO处理前后无明显变化;而2型糖尿病小鼠的肝糖原分子结构稳定性差,α粒子较脆弱,在DMSO中易降解为β粒子。在给予铁皮石斛多糖4周后,给药组小鼠的肝糖原分子结构较模型组小鼠稳定,DMSO处理前后无明显变化,表明铁皮石斛多糖能够改善2型糖尿病小鼠肝糖原分子结构的不稳定性,显著抵抗DMSO对α粒子的降解作用,使其不易降解,从而发挥降糖作用,改善2型糖尿病小鼠的高血糖症。