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鸭甲型病毒性肝炎(Duck hepatitis A virus 1,DHAV-1)属于小RNA病毒科的成员,主要感染4周龄以下的雏鸭,对养殖业危害极大。2C蛋白位于DHAV-1编码的多聚蛋白的P2区,其它小RNA病毒的研究表明,2C蛋白是一种非结构蛋白且在病毒复制复合体的形成过程中起至关重要的作用,但目前未见对DHAV-1 2C蛋白特性及功能研究的报道。本文在对DHAV-1 2C蛋白进行原核表达的基础上,制备出2C蛋白多克隆抗体,检测了 DHAV-12C在鸭胚成纤维(DEF)细胞内的分布情况,同时对2C的NTP酶活性及影响酶活性的关键位点进行了研究,试验结果如下:1.DHAV-12C蛋白的表达、多克隆抗体的制备及亚细胞定位检测将正确扩增的2C片段连入pET32a上,成功构建了 pET32a-2C原核表达载体,将pET32a-2C转入大肠杆菌Rossta(DE3)中,IPTG诱导后2C以不溶性性包涵体的形式表达,Western blot鉴定后可被组氨酸标签抗体识别,大小约为50kDa,纯化2C蛋白,免疫鼠获得了 2C蛋白的多克隆抗体。将2C片段连入pEGFP-C2中,转染DEF细胞,观察2C蛋白单独表达时在细胞中的定位情况,结果显示,转染后24h的2C蛋白在核质均有分布。将DHAV-1感染DEF,间接免疫荧光检测病毒增殖过程中2C蛋白在细胞内的分布情况,结果显示:在病毒感染后4h以前2C蛋白分布在胞浆,6h后开始入核,20h后全部入核,且随着时间的延长不再出核;进一步对2C在高尔基体和内质网中的亚细胞定位进行检测,结果显示,DHAV-1感染DEF 4h后2C蛋白可分布于内质网和高尔基体。2.DHAV-12C蛋白的NTP酶活性及酶活性关键位点的研究将麦芽糖结合蛋白(MBP)片段加在2C序列的N’端后连入pET28a并转入大肠杆菌Rossta(DE3),IPTG诱导表达后获得了可溶性的2C重组融合蛋白。Western blot鉴定表明,2C重组融合蛋白可被组氨酸抗体识别,重组融合蛋白的大小为75kDa。纯化2C重组融合蛋白,用磷酸检测试剂盒可检测到原核表达的可溶性2C重组融合蛋白具有NTP酶活,其dNTP酶水解效率比NTP酶水解效率高,具体水解情况为:dATP>dGTP>dCTP>dTIP>AIP>GTP>UIP>CTP。对其AIP酶活的反应条件进行分析,结果表明酶活性受Mg2+、Mn2+、和Ca2+等常见金属离子的影响且Mg2+>Mn2+>Ca2+>Zn2+,盐离子浓度和pH值也影响ATPase活性,最佳反应条件为Mg2+是2.5mM、NaCl浓度为25mM和pH为8。盐酸胍可抑制ATPase活性,1mM时ATPase活性显著下降,50mM时ATPase酶活完全丧失。为了确定2C的NTP酶活性的关键位点,对生物信息学预测的2C中NTP酶活的关键位点第151位甘氨酸“G”和第152位赖氨酸“K”进行突变,然后检测突变后2C的ATPase活性,结果单独突变赖氨酸和同时突变甘氨酸和赖氨酸均会使酶活性显著降低,但只突变甘氨酸会使酶活性增高。