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目的研究香烟烟雾提取物（CSE）及细菌成分脂多糖（LPS）刺激肺泡上皮细胞PAI-1表达在COPD炎症过程中炎症因子网络形成和炎症细胞趋化中的作用。慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种慢性气道炎症性疾病,以不完全可逆的气流受限为特征,气流受限呈进行性发展,是气道对有害气体或有害颗粒（特别是吸烟）的异常炎症反应。纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）是尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）的主要抑制剂,除了其经典的纤溶功能以外,还可以调节细胞黏附、运动和细胞因子水平,在机体免疫和炎症及感染的控制方面有着重要作用。PAI-1可以调节细胞迁移,但其在细胞迁移中的作用是有争议的,在不同的研究中,PAI-1显示了抑制和促进细胞迁移两种似乎矛盾的作用。PAI-1阻止ECM降解,抑制uPAR依赖的或整合素依赖的细胞黏附,阻断尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）诱导的趋化。通过这些作用,PAI-1抑制细胞迁移。PAI-1通过促进细胞分离,调节趋化物质,及其本身具有的趋化作用来促进细胞迁移。在体内实验中,PAI-1还能够调节某些细胞因子的水平。已证实PAI-1可以通过调节细胞因子的分布来影响细胞因子的水平,它能否直接影响细胞因子的表达有待进一步研究。前期研究显示,PAI-1在COPD患者的诱导痰中表达明显升高,且和肺功能重要指标FEV1%负相关,与重要炎症因子IL-8水平正相关。这提示PAI-1在COPD的炎症过程中扮演着重要角色,因此我们进行本研究来明确PAI-1在COPD炎症中的作用。方法1.培养肺泡上皮细胞（A549细胞株）。2.根据Carp H.等的方法制备CSE。使用不同浓度的CSE和LPS刺激肺泡上皮细胞,ELISA检测细胞上清中PAI-1表达情况,找出PAI-1表达高的最佳刺激浓度进行下续实验。3.用RT-PCR检测CSE或LPS刺激肺泡上皮细胞后PAI-1mRNA表达的变化,用western blotting及免疫细胞化学法检测PAI-1蛋白表达。肺泡上皮细胞上清中的PAI-1及炎症因子IL-8,LTB4的表达使用ELISA检测。分离人静脉血中的单核细胞和中性粒细胞,进行checkerboard实验和Transwell实验,检测CSE和LPS刺激的肺泡上皮细胞趋化炎症细胞的情况。4.分别使用特异的针对PAI-1的3对siRNA转染肺泡上皮细胞,RT-PCR检验干扰效率,选择出干扰效率最高的一对siRNA。5.PAI-1干扰实验分为以下6组:ncRNA空白组,ncRNA+CSE刺激组,ncRNA+LPS刺激组,siRNA空白组,siRNA+CSE刺激组,siRNA+LPS刺激组。使用转染效率最高的PAI-1特异的siRNA或阴性对照ncRNA转染肺泡上皮细胞后,CSE或LPS刺激,使用RT-PCR,western blotting,ELISA,免疫细胞化学法检测PAI-1的表达,ELISA检测IL-8,LTB4的表达。Transwell小室法检测特异性干扰肺泡上皮细胞PAI-1表达后炎症细胞向其趋化的情况。6.用SPSS11.0软件进行统计学分析,两组之间比较采用成组设计资料两样本均数的t检验。结果1.ELISA结果显示暴露于10%CSE与75μg/mlLPS48小时后,PAI-1表达显著升高,且与其他浓度的CSE或LPS刺激产生的PAI-1有显著差异。2.RT-PCR结果显示,暴露于10%CSE或75μg/mlLPS的肺泡上皮细胞PAI-1mRNA表达明显增加;western blotting显示,暴露于10%CSE或75μg/ml LPS的肺泡上皮细胞PAI-1蛋白表达明显增加;免疫细胞化学结果显示,肺泡上皮细胞在受到10%CSE或75μg/ml LPS刺激后,细胞形态与对照组基本一致,而PAI-1呈显著增强的阳性表达;ELISA结果显示细胞上清中PAI-1表达与对照组相比也显著增加（P＜0.05,P＜0.01）,IL-8表达显著增加（P＜0.05,P＜0.01）,LTB4表达显著增加表达（P均＜0.01）。Transwell趋化实验结果显示单核细胞和中性粒细胞的趋化明显加强,10%CSE刺激后分别是对照组的2.8±0.1倍（P＜0.01）及2.45±0.12倍（P＜0.01）,75μg/ml LPS刺激后分别是对照组的2.25±0.11倍（P＜0.01）及2.9±0.15倍（P＜0.01）。3.RT-PCR结果显示,第三对PAI-1特异的siRNA具有最佳的干扰效率,PAI-1mRNA表达水平显著降低。4.免疫细胞化学结果显示,转染ncRNA和siRNA的肺泡上皮细胞形态基本一致,ncRNA+CSE刺激组和ncRNA+LPS刺激组可见肺泡上皮细胞与ncRNA空白组相比有增强的阳性表达,而siRNA空白组,siRNA+CSE刺激组和siRNA+LPS刺激组未见明显的阳性表达。RT-PCR和western blotting结果显示,通过使用PAI-1特异的siRNA,肺泡上皮细胞的PAI-1mRNA及蛋白表达都明显抑制,在受到CSE和LPS刺激后,也未见明显增加。ELISA结果显示,上清中IL-8表达siRNA空白组明显少于ncRNA空白组（P＜0.01）,siRNA+CSE刺激组IL-8表达与ncRNA+CSE刺激组相比较,明显减少（P＜0.05）。siRNA+CSE刺激组上清中LTB4表达显著低于ncRNA+CSE刺激组（P＜0.01）,siRNA+LPS刺激组上清中LTB4表达显著低于ncRNA+LPS刺激组（P＜0.01）。单核细胞和中性粒细胞的趋化在特异性干扰PAI-1表达后明显减弱。单核细胞趋化siRAN+CSE刺激组与ncRNA+CSE刺激组相比,siRAN+LPS刺激组与ncRNA+LPS刺激组相比,均明显减弱（P均＜0.01）。中性粒细胞趋化siRAN+CSE刺激组与ncRNA+CSE刺激组相比,siRAN+LPS刺激组与ncRNA+LPS刺激组相比,也同样显著减弱（P均＜0.01）。结论1.通过暴露于CSE和LPS,肺泡上皮细胞PAI-1、炎症因子（IL-8与LTB4）表达被明显诱导,炎症细胞（单核细胞和中性粒细胞）被趋化。2.PAI-1是调节CSE和LPS刺激的肺泡上皮细胞IL-8和LTB4表达的上游促炎症因子。3.PAI-1能够促进CSE和LPS刺激的肺泡上皮细胞对炎症细胞的趋化。4.干扰PAI-1表达可下调炎症因子表达,减少炎症细胞募集,进而减轻炎症反应。