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背景:RhD抗原引起的胎儿及新生儿溶血病(hemolytic disease of the newborn,HDFN)可严重影响胎儿及新生儿健康,抗-D免疫球蛋白(anti-D immune globulin,RhIg)可预防此疾病发生。欧美国家从上世纪60年代开始使用RhIg预防胎儿及新生儿溶血性疾病,效果显著。我国RhD阴性比例约0.5%,但是我国人口基数大,并且随着我国二孩政策全面放开,RhIg的需求量不断增加。由于我国没有RhIg上市并且没有正规购买进口产品途径。自主研究RhD主动免疫有效性及安全性并生产RhIg在我国预防HDFN中起着关键作用。与此同时,国外RhIg研究中发现一部分RhD阴性者不对RhD 阳性红细胞产生免疫应答,这一部分人群通常被称为“不应答者”,目前“不应答者”的发生机制还不清楚。有研究表明Toll样受体3(Toll like receptor 3,TLR3)在小鼠红细胞同种免疫发生过程中起着关键作用,TLR3激活可释放I型干扰素(interferon,IFN),后者也被证实在小鼠红细胞同种免疫中为必不可少的细胞因子。因此,TLR3及I型IFN可能与RhD同种免疫发生相关。此外,基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)现已用于红细胞同种免疫易感性研究。由于临床输血为RhD同型输血,产生RhD同种免疫的应答者很少,而RhE同种免疫为汉族人群最常见,可探究RhE同种免疫发生的基因易感性,并为RhD同种免疫发生的基因易感性研究提供参考。目的:本研究旨在通过RhD 阳性红细胞主动免疫RhD阴性献浆员,对RhD主动免疫有效性及安全性进行研究,优化免疫方案,为我国生产RhIg提供理论支持;其次利用RhD主动免疫中获得的“应答者”及“不应答者”样本,探讨TLR3及I型IFN与RhD主动免疫发生的相关性;最后通过分析TLR3、IL17F、ERAP1和ERAP2基因中错义突变SNPs,初步探究RhE同种免疫发生基因易感性,并为RhD同种免疫基因易感性研究提供参考。方法:1)对23例RhD阴性献浆员进行RhD 阳性红细胞免疫,研究分为初始免疫(以下简称初免)及加强免疫。初免分为首次初免,二次初免,三次初免。一旦献浆员产生RhD应答即进行加强免疫。免疫后采集血样,检测抗-D效价、血常规、肝肾功能及凝血常规,以分析RhD主动免疫有效性及安全性。2)采用竞争酶免疫分析法检测抗-D浓度,分析抗-D浓度与效价的相关性;ELISA检测RhD“应答者”与“不应答者”血清TLR3及I型IFN水平。将RhD抗原多肽与 RhD“应答者”外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear nucleus,PBMC)共培养作为对照组;抗-TLR3抗体与“应答者”PBMC培养后再与RhD抗原多肽共培养作为实验者,比较两组细胞增殖情况及细胞培养上清TLR3表达。3)RhE应答者作为实验组及健康献血员作为对照组,选择免疫相关基因TLR3、IL17F、ERAP1和ERAP2,根据NCBI数据库选择以上基因汉族人群最小等位基因频率(MAF)>0.05;错义突变SNPs。通过实时荧光PCR进行检测。4)使用SPSS20.0根据不同数据类型采用相应统计学方法进行分析。结果:1)RhD主动免疫有效性研究中,首次初免应答率为35.3%,总应答率为73.3%;首次初免40-50ml应答率比20-30ml高(62.5%和11.1%,P=0.043),具有统计学差异;初免40-50ml与20-30rml总应答率相当(71.4%和75.0%,P=1),无统计学差异;首次初免40-50ml 比20-30ml产生抗体更早(2.83±0.98个月和5.40±1.34个月,P=0.03),具有统计学差异;抗-D效价在加强免疫1周内达到最高;加强免疫2ml比0.5ml抗-D效价增高倍数高(20.11±2.31及3.03±1.85,P=0.002),具有统计学差异;加强免疫≥2次比1次效价增高倍数高(474.41±1.72及101.83±2.04,P<0.001),具有统计学差异;<1个月及2-3个月、<1个月及2-3个月及1-2个月及2-3个月效价下降倍数分别为(1.52±1.79及3.23±2.81,P=0.04)、(1.52± 1.79 及 13.45±2.04,P<0.001)及(3.23±2.81 及 13.45±2.04,P=0.001),具有统计学差异。2)RhD主动免疫安全性研究中,初免及加强免疫后献浆员生命体征均正常;首次初免20-30ml与40-50ml后24小时及1周血常规、肝肾功能及凝血常规分别统计分析,P值均>0.05,无统计学差异;0.5ml加强免疫24小时及1周后以上指标与RhD应答前基础值分别统计分析,P值均>0.05,无统计学差异;1,2 ml加强免疫24小时后总胆红素及间接胆红素比RhD应答前高(12.22±4.68及8.28±3.14,P=0.03;9.15±3.66 及 6.31±2.98,P=0.048);1 周后总胆红素比 Rh D应答前高(12.73±5.76及8.28±3.14,P=0.03),具有统计学差异。其他无统计学差异,P值均>0.05;进行1ml及2ml加强免疫24小时后分别有1名献浆员间接胆红素升高临近医学参考值上限及超过医学参考值范围。3)抗-D浓度检测标准曲线r2>0.99;抗-D浓度和效价回归模型Y=6.829+0.158X(X为效价,Y为浓度),回归方程r2=0.932,P<0.001。当抗-D效价>128时,抗-D浓度>20IU/ml,可进行采浆生产。4)RhD应答组血清中可检测到TLR3,RhD不应答组未能检测TLR3表达;应答组较不应答组血清I型IFN(IFN-α及IFN-β)水平高,P值分别为0.032及0.049,具有统计学差异;TLR3与IFN-α及IFN-β建立线性回归模型,r2为0.92,P值为0.001;r2为0.92,P值为0.001,具有统计学差异;对照组比实验组TLR3水平及细胞增殖更高,P值<0.001,存在统计学差异。5)RhE应答组IL17F基因rs763780的C等位基因和CC+CT基因型增高(14.2%和5.1%,P<0.001;23.2%和 9.7%,P=0.004)。rs763780 为 CC+CT 基因型的个体发生RhE应答的风险较高。(OR,2.81;95%可信区间,1.42—5.56)。其他3个SNPs之间无显著差异。结论与意义:1)首次初免40-50ml 比 20-30ml更优,加强免疫间隔期可缩短至1个月,加强免疫2ml及2次以上效价增高更显著,加强免疫0.5ml相对更安全,加强免疫2次后7天(效价>128)考虑采浆。根据现有的免疫方案,可进行免疫方案的优化。2)抗-D浓度与效价呈良好的相关性。同等实验条件下,可根据抗-D效价预测抗-D浓度。抗-D的定量检测有助于RhD主动免疫中RhIg定量的标准化及规范化。3)TLR3-I型IFN途径与RhD同种免疫相关。可为RhD同种免疫发生机制进一步研究提供参考。4)在汉族人群中,IL17F基因中的SNP rs763780与RhE同种免疫相关,等位基因C为风险等位基因。可为RhD同种免疫及其他红细胞同种免疫的基因易感性研究提供参考。