犬瘟热病毒核蛋白基因的克隆与原核及真核表达

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犬瘟热是严重威胁我国养犬业发展的主要传染病之一,免疫接种是预防此病的重要措施;为克服常规疫苗的不足,我们构建了犬瘟热核蛋白(N)基因的重组质粒,这为研制新一代安全高效、使用方便的核酸疫苗打下基础。 以犬瘟热病毒OP株感染Vero细胞收获病毒提取的RNA为模板,根据已发表的犬瘟热病毒OP株序列设计两对引物,RT-PCR扩增出N基因的822bp、897bp片段。将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆进pGEX-6p-1载体中谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因的下游,再将重组质粒转化进宿主菌BL21中,在37℃ 1.0mM IPIG的诱导下,核蛋白基因分段获得了良好的表达,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,确定其表达融合蛋白质的大小分别52kDa、54kDa。将表达产物回收后混合免疫小鼠,间接免疫荧光试验(IFA)显示免疫小鼠的血清能与病毒感染的细胞呈现特异反应,表明体外表达核蛋白基因保留了天然蛋白部分的抗原性。 设计含EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点的一对引物,采用RT-PCR法从犬瘟热OP株感染Vero细胞收获的病毒中扩增出CDV N全段,定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,转化感受态大肠杆菌DH5。,经氨苄抗性和限制性内切酶酶切等鉴定,证实构建成功;用脂质体转染剂转入到COS-7细胞,间接免疫荧光试验检验表明目的基因在COS-7细胞获得了瞬时表达;并与PEI混合肌注小鼠,ELISA检测证明获得了较高的抗体滴度,为进一步研究CDV核蛋白基因的功效及制备核酸疫苗奠定物质基础。
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