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目的显微镜下多血管炎(microscopic polyangiitis,MPA)是一类主要表现为小血管损伤的系统性自身免疫疾病。MPA的病因及其发病机制目前仍未完全阐明。大量的血管内皮损伤是MPA的临床病理特征之一。外泌体是一类直径30～100nm的脂质双分子层包裹的微小囊泡,通过转运生物信息分子到受体细胞在各种生物过程中发挥作用。microRNA(miRNA)是一类小非编码RNA,在转录后翻译过程中发挥重要作用。已有研究报道在其他疾病中外泌体miRNA差异表达,且参与了内皮损伤。由此推测外泌体参与了MPA内皮损伤,该作用很有可能是由差异表达的miRNA介导的。方法1.采用超速离心法分离获取外泌体。2.采用透射电镜分析鉴定外泌体形态和粒径分布。3.采用蛋白印迹鉴定外泌体表面标记蛋白CD63、TSG101、CD9。4.采用用DiI和DAPI染色在荧光显微镜下观察外泌体被内皮细胞摄取。5.采用ELISA检测外泌体与内皮细胞共孵育后上清中sICAM-1和sVCAM-1的表达。6.采用Transwell小室检测外泌体与内皮细胞共孵育后屏障功能的改变。7.采用miRNeasy Micro试剂盒提取血浆外泌体总RNA。使用NEBNext?Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina?构建小RNA文库,并进行PCR扩增、质量检测。8.采用Illumina Hiseq 2500/2000平台进行高通量测序,获得血浆外泌体mi RNA表达谱,并使用q RT-PCR验证。9.采用生物信息学分析差异表达的MPA血浆外泌体(MPA-exo)mi RNA的靶基因及其功能。10.采用相关性分析探究差异表达的外泌体mi R-185-3p和mi R-125a-3p与MPA临床指标的相关性。结果1.透射电镜结果显示超离获得的微囊泡为不规则球形,直径集中在50～100nm之间。2.蛋白印迹结果显示超离获得的微囊泡表达外泌体标记蛋白CD63、TSG101和CD9。3.荧光显微镜观察得到在4h内皮细胞摄取DiI标记的外泌体,8h摄取的更多。4.ELISA结果显示与对照组相比,MPA-exo与内皮细胞共孵育后上清中s ICAM-1和s VCAM-1的表达升高。5.Transwell实验结果显示与对照组相比,MPA-exo与内皮细胞共孵育后内皮细胞的屏障功能受损。6.高通量测序和差异分析结果显示MPA-exo中有32个差异表达的miRNAs,其中12个表达上调,20个表达下调。qRT-PCR实验结果证实测序结果可靠。7.GO富集分析结果显示MPA-exo差异表达的miRNA靶基因在生物过程中主要富集于代谢过程;在细胞组分中主要富集于细胞内和胞质;在分子功能中主要富集于蛋白结合及催化活性。KEGG富集分析结果显示MPA-exo差异表达的mi RNA靶基因可显著富集在VEGF、MAPK、NOD样受体信号通路等。8.MPA血浆外泌体差异表达的目的miRNA与临床指标的相关性分析结果显示,miR-185-3p和miR-125a-3p与MPA的BVAS、ESR和24小时尿蛋白显著相关,与CRP无显著相关。结论1.MPA患者血浆外泌体被成功分离获取,并显示可以促进内皮损伤。2.MPA-exo中32个miRNAs差异表达,且这些差异表达的miRNAs很有可能参与了MPA的内皮损伤。3.miR-185-3p和miR-125a-3p可能是MPA疾病活动度评估的潜在生物标记物。本课题研究结果显示MPA患者血浆中差异表达的miRNAs可能参与内皮损伤机制,提示差异表达的miRNAs及其靶基因可能影响了MPA中血管的炎症进程。