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红松籽油是从红松种籽中提取的一种天然油脂,其中含有丰富的亚油酸,油酸和皮诺敛酸等不饱和脂肪酸,其生物活性极其丰富,其中的皮诺敛酸是松籽油中特有的18个碳的不饱和脂肪酸。本文首次研究了皮诺敛酸抑制油酸诱导HepG2细胞中脂质积累及其初步分子机制。此外左旋肉碱是从红色肉类中提取出的一种类维生素,对减肥及脂肪的消耗有显著的作用。为达到最佳的降脂效果,本论文研究了皮诺敛酸/左旋肉碱复配物的最佳降脂浓度配比。本文主要研究成果如下:1.皮诺敛酸具有抑制HepG2细胞脂质累积作用。MTT实验结果表明0.5 mM油酸对HepG2及L02细胞的生存率没有显著的抑制作用,油红O染色结果表明,0.5 mM油酸处理HepG2细胞24h时,细胞内产生大量的脂滴。因此,采用0.5mM油酸培养HepG2细胞24 h,成功诱导HepG2细胞成脂。MTT实验表明皮诺敛酸处理HepG2及L02细胞12h时,其细胞生存率较高,40μM浓度以下的皮诺敛酸对HepG2及L02细胞均无显著的抑制作用。皮诺敛酸(10、15、20、25 μM)预处理12 h后,HepG2细胞内脂滴量、甘油三酯和总胆固醇含量显著降低(与模型组相比),表明皮诺敛酸具有抑制细胞脂质累积的作用。2.皮诺敛酸可通过调节氧化应激途径改善油酸诱导的HepG2细胞脂质积累。采用含有皮诺敛酸(10,15,20,25 μM)和生理盐水空白对照的培养基孵育HepG2细胞12 h,然后用0.5 mM油酸处理细胞24 h。皮诺敛酸预处理后,HepG2细胞内超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的表达具有显著的提升,而脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的水平显著的降低。此外,皮诺敛酸能显著的阻滞油酸引起的细胞内活性氧(ROS)产生,同时,促进细胞内Nrf2和血红素氧化酶-1(HO-1)蛋白水平的表达(同油酸组比较)。以上结果表明皮诺敛酸能够通过抑制氧化应激损伤途径降低细胞脂质的积累。3.皮诺敛酸通过调节AMPK/SIRT1通路抑制HepG2细胞脂质积累。Western blot实验结果表明,同空白对照相比,油酸处理组明显的增加了 HepG2细胞中脂肪酸合成酶(FASN)、固醇调节元件结合蛋白(SREBP1c)及硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD1)的水平,而皮诺敛酸(10,15,20,25 μM)预处理组其蛋白水平显著低于油酸处理组,并呈现剂量依赖性。AMPK、SIRT1蛋白水平的变化与脂肪酸氧化有密切的关系。经油酸处理HepG2细胞后,AMPK磷酸化水平被抑制,蛋白活性受到破坏,转录沉默信息调节因子(SIRT1)和过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)蛋白表达量也被降低。而皮诺敛酸预处理的HepG2细胞内AMPK磷酸化水平得到一定程度的恢复,SIRT1和PPARα蛋白的水平同样得到了回升。采用AMPK的抑制剂compound C处理细胞,结果表明AMPK磷酸化水平被抑制,同时SIRT1和PPARα蛋白表达也受到抑制,说明皮诺敛酸可以激活AMPK/SIRT1信号通路抑制细胞脂质累积。4.皮诺敛酸/左旋肉碱复配物可有效降低HepG2细胞中脂质的积累。分别采用含50%皮诺敛酸的松籽油或左旋肉碱,处理HepG2细胞12 h,MTT实验结果表明25 μM以下的皮诺敛酸对细胞生长无显著的抑制作用,同时500 μM以下的左旋肉碱对细胞生长也无显著的抑制作用。油红O染色结果表明,皮诺敛酸抑制脂质积累的最适浓度是6.25 μM,左旋肉碱抑制脂质积累的最适浓度是250 μM。皮诺敛酸/左旋肉碱复配物抑制脂质积累的最适浓度配比为是1 μM皮诺敛酸复配40 μM左旋肉碱。说明皮诺敛酸与左旋肉碱复配物在降低HepG2细胞脂质积累中具有用量少,作用效果显著的特点。综上所述,皮诺敛酸预处理可抑制脂质过氧化作用,也可以降低FASN、SREBP1c及SCD1等促进脂肪合成的蛋白,抑制脂肪的积累。同时皮诺敛酸可以激活AMPK的磷酸化,以及其下游的SIRT1/PPARα信号通路,促进脂质的分解,达到降脂的功效。此外,优化出皮诺敛酸/左旋肉碱复配物的最佳降脂比例,为研制减肥降脂的高端产品提供了一定科学依据。