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铁是人体所必需的微量元素，参与血红蛋白、肌红蛋白、氧化呼吸链等重要生命物质的合成。铁稳态代谢调控对维持机体健康十分重要。铁缺乏会出现缺铁性贫血；而铁的蓄积会导致细胞死亡、组织损伤，甚至引发疾病，如遗传性血色病、地中海贫血等。铁调素是由肝脏分泌，具有调控机体铁代谢作用的核心激素，可以通过诱导小肠上皮细胞和巨噬细胞表面的铁外排转运蛋白降解来抑制机体铁吸收和铁循环，维持机体的铁稳态平衡。
铁稳态失衡，尤其是铁过载，会导致一系列重大慢性疾病，如肝硬化、肿瘤、心血管疾病、糖尿病等，严重影响了我国居民的生活质量，但目前临床上铁过载治疗手段极为有限。近年来，筛选合成靶向调控铁调素的小分子化合物是铁代谢疾病治疗领域的热点。但是新化合物开发的成本高、成药过程复杂而漫长、临床试验不确定性大，更多的研究者将目光投向了临床上正在使用的“老药”上，探索这些“老药”新的治疗作用。实验团队针对“640种已被FDA批准可用于临床的小分子药物”进行靶向铁调素的功能筛查，开展了一系列研究。
目的：
1对“640种已被FDA批准可用于临床的小分子药物”进行初筛，发现新的调节铁调素的小分子化合物（金诺芬）。
2通过体内体外实验，探究候选小分子化合物（金诺芬）对铁调素的调控作用及分子机制，进一步丰富铁代谢稳态调控网络。
3探索候选小分子化合物（金诺芬）对铁过载（血色病）小鼠模型机体铁蓄积的改善作用，为治疗铁蓄积相关疾病提供实验理论依据。
方法：
1根据实验目的不同，分别用6孔板、24孔板、96孔板培养Huh7细胞，加入药物处理后，直接检测细胞活性或是提取细胞RNA、蛋白进行检测。在HEK293T细胞中用Lip2000转染质粒HAMP-promoter2.7kb-pGL3和内参Renilla，并用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测金诺芬对HAMP基因启动子的活性。
2C57BL/6小鼠（8周龄，包括雌雄）给予急性注射，采用腹腔注射的方式，注射金诺芬5mg/kg，然后分别在注射后的0小时、3小时、6小时、12小时及24小时对相应组别的小鼠处理、采集组织样品。8周龄Hfe-/-小鼠随机分为对照组和实验组，雌雄分别分组，每组10只，共40只小鼠。实验组给予5mg/kg金诺芬，对照组注射同等剂量的生理盐水（溶剂）。采取腹腔注射的方式，每天注射一次，连续注射6周后处理小鼠、取组织样品。
3用Trizol法提取细胞及组织的RNA，反转录cDNA，实时荧光定量PCR检测基因的mRNA表达水平，β-ACTIN作为内参基因。用RIPA裂解液裂解细胞及组织，提取细胞及组织总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，western blot检测蛋白表达水平。
4使用Pointe Scientific的Iron/TIBC Reagent Set试剂盒测量血清铁的相关指标。用LEGEND MAX?Mouse IL-6ELISA Kit with Pre-coated Plates试剂盒检测血清IL-6水平。分别用订购于南京建成生物工程研究所的谷丙转氨酶（ALT/GPT）测试盒（微板法）、谷草转氨酶（AST/GOT）测试盒（微板法）检测血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶。通过普鲁士蓝染色法检测肝脏组织铁分布情况，免疫组织化学技术检测十二指肠组织铁转运蛋白的表达水平。
5所有符合正态分布的定量数据均以均数±标准差表示，多组之间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两组之间比较采用独立样本的t检验，p＜0.05为差异有统计学意义。
结果：
1在小分子药物库初筛实验中，发现金诺芬具有明显上调Huh7细胞的HAMP1表达水平的作用，综合其临床应用情况，推测金诺芬是潜在的铁调素激动剂。
2通过进一步的细胞实验，发现金诺芬对于铁调素的调控作用与药物浓度和作用时间相关。通过基因及蛋白检测，发现在合适的浓度和作用时间下，金诺芬能够显著上调铁调素的表达，信号传导通过BMP/SMAD通路及JAK/STAT通路。
3通过对C57BL/6小鼠体内的急性实验，发现金诺芬对体内铁调素的表达也有上调作用。金诺芬通过NF-κB通路上调体内的IL-6水平，继而增强STAT3的磷酸化，激活铁调素的表达。
4对血色病模型小鼠（Hfe-/-小鼠）进行6周持续腹腔注射金诺芬后，发现Hfe-/-雄性小鼠体内铁调素上升，机体铁水平下降，而Hfe-/-雌性小鼠体内的铁调素及机体铁水平并没有出现明显变化。后续的实验结果提示，雌激素可以抑制金诺芬调控铁调素的作用。同时，通过检测小鼠的肝脏功能及体重变化，发现金诺芬6周的持续注射没有引起小鼠脏器的损伤。
结论：
1通过对“640种已被FDA批准可用于临床的小分子药物”的药物筛选，发现金诺芬是潜在的铁调素激动剂。
2阐明金诺芬通过激活NF-κB-IL-6-JAK/STAT信号通路上调铁调素表达的分子机制。
3金诺芬通过上调铁调素显著减轻Hfe-/-雄性小鼠的铁蓄积，有望应用于铁过载疾病的降铁治疗。
铁稳态失衡，尤其是铁过载，会导致一系列重大慢性疾病，如肝硬化、肿瘤、心血管疾病、糖尿病等，严重影响了我国居民的生活质量，但目前临床上铁过载治疗手段极为有限。近年来，筛选合成靶向调控铁调素的小分子化合物是铁代谢疾病治疗领域的热点。但是新化合物开发的成本高、成药过程复杂而漫长、临床试验不确定性大，更多的研究者将目光投向了临床上正在使用的“老药”上，探索这些“老药”新的治疗作用。实验团队针对“640种已被FDA批准可用于临床的小分子药物”进行靶向铁调素的功能筛查，开展了一系列研究。
目的：
1对“640种已被FDA批准可用于临床的小分子药物”进行初筛，发现新的调节铁调素的小分子化合物（金诺芬）。
2通过体内体外实验，探究候选小分子化合物（金诺芬）对铁调素的调控作用及分子机制，进一步丰富铁代谢稳态调控网络。
3探索候选小分子化合物（金诺芬）对铁过载（血色病）小鼠模型机体铁蓄积的改善作用，为治疗铁蓄积相关疾病提供实验理论依据。
方法：
1根据实验目的不同，分别用6孔板、24孔板、96孔板培养Huh7细胞，加入药物处理后，直接检测细胞活性或是提取细胞RNA、蛋白进行检测。在HEK293T细胞中用Lip2000转染质粒HAMP-promoter2.7kb-pGL3和内参Renilla，并用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测金诺芬对HAMP基因启动子的活性。
2C57BL/6小鼠（8周龄，包括雌雄）给予急性注射，采用腹腔注射的方式，注射金诺芬5mg/kg，然后分别在注射后的0小时、3小时、6小时、12小时及24小时对相应组别的小鼠处理、采集组织样品。8周龄Hfe-/-小鼠随机分为对照组和实验组，雌雄分别分组，每组10只，共40只小鼠。实验组给予5mg/kg金诺芬，对照组注射同等剂量的生理盐水（溶剂）。采取腹腔注射的方式，每天注射一次，连续注射6周后处理小鼠、取组织样品。
3用Trizol法提取细胞及组织的RNA，反转录cDNA，实时荧光定量PCR检测基因的mRNA表达水平，β-ACTIN作为内参基因。用RIPA裂解液裂解细胞及组织，提取细胞及组织总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，western blot检测蛋白表达水平。
4使用Pointe Scientific的Iron/TIBC Reagent Set试剂盒测量血清铁的相关指标。用LEGEND MAX?Mouse IL-6ELISA Kit with Pre-coated Plates试剂盒检测血清IL-6水平。分别用订购于南京建成生物工程研究所的谷丙转氨酶（ALT/GPT）测试盒（微板法）、谷草转氨酶（AST/GOT）测试盒（微板法）检测血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶。通过普鲁士蓝染色法检测肝脏组织铁分布情况，免疫组织化学技术检测十二指肠组织铁转运蛋白的表达水平。
5所有符合正态分布的定量数据均以均数±标准差表示，多组之间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两组之间比较采用独立样本的t检验，p＜0.05为差异有统计学意义。
结果：
1在小分子药物库初筛实验中，发现金诺芬具有明显上调Huh7细胞的HAMP1表达水平的作用，综合其临床应用情况，推测金诺芬是潜在的铁调素激动剂。
2通过进一步的细胞实验，发现金诺芬对于铁调素的调控作用与药物浓度和作用时间相关。通过基因及蛋白检测，发现在合适的浓度和作用时间下，金诺芬能够显著上调铁调素的表达，信号传导通过BMP/SMAD通路及JAK/STAT通路。
3通过对C57BL/6小鼠体内的急性实验，发现金诺芬对体内铁调素的表达也有上调作用。金诺芬通过NF-κB通路上调体内的IL-6水平，继而增强STAT3的磷酸化，激活铁调素的表达。
4对血色病模型小鼠（Hfe-/-小鼠）进行6周持续腹腔注射金诺芬后，发现Hfe-/-雄性小鼠体内铁调素上升，机体铁水平下降，而Hfe-/-雌性小鼠体内的铁调素及机体铁水平并没有出现明显变化。后续的实验结果提示，雌激素可以抑制金诺芬调控铁调素的作用。同时，通过检测小鼠的肝脏功能及体重变化，发现金诺芬6周的持续注射没有引起小鼠脏器的损伤。
结论：
1通过对“640种已被FDA批准可用于临床的小分子药物”的药物筛选，发现金诺芬是潜在的铁调素激动剂。
2阐明金诺芬通过激活NF-κB-IL-6-JAK/STAT信号通路上调铁调素表达的分子机制。
3金诺芬通过上调铁调素显著减轻Hfe-/-雄性小鼠的铁蓄积，有望应用于铁过载疾病的降铁治疗。