【摘 要】
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目的:利用Cre-LoxP系统构建内皮细胞特异性Piezo1敲除小鼠,研究Piezo1在骨折愈合中的作用及机制。方法:利用免疫荧光技术,观察Piezo1在骨脉管系统中的表达和分布;构建内皮细胞特异性Piezo1敲除小鼠,流式细胞术分选骨内皮细胞,qRT-PCR、WB验证Piezo1在Piezo1fl/fl小鼠和Piezo1ΔEC小鼠中的表达;建立股骨横断骨折模型,Micro-CT观察内皮细胞特异性
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目的:利用Cre-LoxP系统构建内皮细胞特异性Piezo1敲除小鼠,研究Piezo1在骨折愈合中的作用及机制。方法:利用免疫荧光技术,观察Piezo1在骨脉管系统中的表达和分布;构建内皮细胞特异性Piezo1敲除小鼠,流式细胞术分选骨内皮细胞,qRT-PCR、WB验证Piezo1在Piezo1fl/fl小鼠和Piezo1ΔEC小鼠中的表达;建立股骨横断骨折模型,Micro-CT观察内皮细胞特异性Piezo1敲除对骨折修复的影响;利用激光共聚焦观察Piezo1fl/fl小鼠和Piezo1ΔEC小鼠骨折局部EMCN、RUNX2和OSX的表达;利用微血管造影技术观察Piezo1对骨折愈合过程中血管生成的作用;通过三点弯曲实验测试骨骼的力学性能;利用钙蛋白酶活性检测试剂盒测定内皮细胞特异性Piezo1敲除对血管活化过程中钙蛋白酶活性的影响;qRT-PCR、WB测定Piezo1对PI3K-AKT磷酸化水平和Notch信号的影响。结果:免疫染色结果显示,Piezo1表达于骨脉管系统中的内皮细胞。Micro-CT结果显示,Piezo1fl/fl小鼠在骨折后21天在骨折部位形成大量的骨痂,并可见部分骨痂桥接,在骨折后42天完成骨重塑。相反,Piezo1ΔEC小鼠在骨折后21天虽然有骨痂形成,但未观察到骨痂的桥接,在骨折后42天时仍可观察到骨不连。形态计量学分析结果显示,在骨折后21天和42天时,Piezo1ΔEC小鼠的骨小梁体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁数目（Tb.N）均低于Piezo1fl/fl小鼠,而骨小梁分离度（Tb.Sp）显著高于Piezo1fl/fl小鼠。免疫染色结果显示,Piezo1ΔEC小鼠在骨折后21天和42天时骨折局部EMCN、RUNX2和OSX的表达显著低于Piezo1fl/fl小鼠。微血管造影结果显示,Piezo1fl/fl小鼠在骨折后21天时在骨折部位形成的新生血管数目显著多于Piezo1ΔEC小鼠。在骨折后42天,Piezo1fl/fl小鼠骨折部位的血管基本恢复正常状态,而Piezo1ΔEC小鼠血管形成受损。三点弯曲试验结果显示,在骨折后21天和42天时,Piezo1ΔEC小鼠股骨的极限载荷（Yield Load）和弯曲刚度（Bending Stiffness）均明显低于Piezo1fl/fl小鼠。在骨折后21天和42天时,Piezo1ΔEC小鼠的钙蛋白酶活性显着低于Piezo1fl/fl小鼠。在骨折后42天时,Piezo1ΔEC小鼠骨折部位PI3K和AKT磷酸化水平明显低于Piezo1fl/fl小鼠。与Piezo1fl/fl小鼠相比,Piezo1ΔEC小鼠骨折部位血小板-内皮细胞粘附分子（Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1/CD31）和Notch1细胞内结构域（Notch1 intracellular domain,N1ICD）的表达水平下调。结论:内皮细胞特异性Piezo1敲除会导致骨折修复受损,血管活化过程中钙蛋白酶活性降低,PI3K-AKT磷酸化水平和Notch信号下调。Piezo1介导的血管生成在骨折愈合中发挥重要作用。Piezo1是促进骨再生和治疗骨折愈合延迟或骨不连的潜在靶标。
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