论文部分内容阅读
目的:ADM诱导建立稳定的肝癌耐药细胞模型,破坏耐药细胞脂筏结构,明确脂筏是否及如何调节Erk1/2信号通路活性及肝癌耐药细胞耐药性。方法:1.采用ADM大剂量间歇冲击诱导肝癌耐药细胞。MTS法检测不同浓度ADM作用下细胞增殖抑制率,SPSS软件进行Probit分析并计算半数抑制浓度(IC50)获得耐药指数。2.甲基-β-环糊精(MβCD)消耗胆固醇破坏脂筏结构,用AlexaFluor488-CtxB标记脂筏,激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光的多少判断脂筏含量,验证MβCD破坏效果。3.Western Blot检测脂筏破坏前后和PD98059作用后Erkl/2信号通路相关蛋白表达及磷酸化水平,ImageJ gray scale scanning software进行定量分析。4.MTS检测脂筏破坏前后及PD98059作用后肝癌耐药细胞株在不同浓度ADM作用下的细胞增殖抑制率并计算耐药逆转倍数。5.流式细胞仪检测脂筏破坏前后和PD98059作用后ADM(1 mg/L)诱导24小时后的细胞凋亡率。6.流式细胞仪检测脂筏破坏前后5μg/ml罗丹明123孵育细胞45min后细胞内罗丹明123的荧光强度,Western Blot检测脂筏破坏前后p-gp的蛋白表达。结果:1.诱导得到耐药细胞株:SMMC7721/ADM、BEL7402/ADM。与亲本细胞相比,耐药细胞在0.25,1,4,16 and 64 μg/mlADM作用下对阿霉素的敏感性明显下降,细胞增殖抑制率降低,IC50显著升高,SMMC7721/ADM、BEL7402/ADM的耐药指数分别为17.07、14.28。耐药细胞株与亲本株相比,Erk1/2,MEK,c-Raf总表达及磷酸化表达p-Erk1/2,p-MEK,p-c-Raf均明显增加。2.MβCD作用于耐药细胞后,激光共聚焦显微镜下绿色荧光明显减弱,即脂筏含量明显降低,说明MβCD破坏脂筏效果明显。3.MβCD破坏脂筏后,p-Erk1/2,p-MEK,p-c-Raf蛋白表达明显增强,而Erk1/2,MEK,c-Raf总蛋白表达基本没变;P-EGFR表达明显增强。用PD98059作用后Erk1/2磷酸化水平明显降低。4.MβCD 破坏脂筏后,SMMC7721/ADM 和 BEL7402/ADM 细胞对 ADM 的IC50 分别降到 1.71±0.142μg/ml、1.467±0.17μg/ml,逆转倍数为 2.79、1.77。PD98059作用后,SMMC7721/ADM和BEL7402/ADM细胞对ADM的IC50分别降到3.324±0.184μg/ml、1.879±0.174μg/ml,逆转倍数为 1.43、1.38。MβCD、PD98059联合作用后,肝癌耐药细胞对ADM的IC50分别降到1.552±0.037μg/ml、1.334±0.079μg/ml,逆转倍数为3.07、1.95,逆转倍数高于单独使用。5.MβCD破坏脂筏后,细胞株对ADM的敏感性增加,1mg/LADM诱导后细胞凋亡增加。PD98059作用后,细胞凋亡增加。MβCD、PD98059联合作用后,细胞凋亡增加高于单独使用。6.MβCD作用后,流式细胞仪检测细胞内罗丹明123蓄积增加,外排减少,P-gp活性减弱;P-gp蛋白表达没有明显改变。结论:1.Erk1/2信号通路高表达与肝癌细胞耐药性正相关。2.MβCD破坏脂筏,Erk1/2信号通路活性增加。3.MβCD破坏脂筏,肝癌耐药细胞p-gp活性降低,耐药性降低。4.MβCD破坏脂筏后PD98059抑制Erk1/2通路活性,肝癌细胞耐药性降低,证实了脂筏破坏后Erk1/2信号通路仍然参与耐药性的调节。