研究背景根据最新数据统计,肝癌(Liver Cancer)是常见恶性肿瘤之一,也是全球第四大肿瘤相关死因,预后较差,5年生存率大约为18%。肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)占据绝大多数肝癌的病理学类型,本文中HCC即指代肝癌。在过去的20年里,虽然部分危险因素如丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV),乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染和黄曲霉素暴露虽然有所控制,HCV直接作用抗病毒(Direct Acting Anti-viral,DAA)药物的问世迈入丙肝治愈时代,HBV抗病毒药物核苷类似物也实现了 HBV的临床治愈,大大降低了 HCC潜在风险。但是,病毒、饮酒、肥胖、非酒精性脂肪性肝病等因素的持续性存在,肝癌的发病率仍然居高不下,给国家人民引起了一定的健康损失和经济负担。作为一种侵袭性实体瘤,肝癌具有转移早、生长浸润迅速、预后差和恶性程度高等特点。对于肝癌的常规治疗主要是外科肿瘤手术切除或消融、动脉化疗栓塞、肝移植和使用酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼等内科治疗,但肝癌作为恶性肿瘤的高转移率和高复发率导致目前临床治疗效果欠佳,患者发生肿瘤相关死亡风险大。在肿瘤发生发展过程中,体细胞的恶性转化多伴有遗传学和表观遗传学的改变。比如抑癌基因的失活和致癌基因的激活,基因的甲基化、羟甲基化等。这些事件可诱发多种肿瘤相关抗原的产生,突变形成新的抗原或抗肿瘤免疫反应的靶点。因此,研究肿瘤发生发展过程中基因的异常表达,加深对肿瘤的进一步认识,可能为肿瘤的诊断手段和治疗效果的提高提供一定的理论依据。大量研究报道表明基因的表达以及细胞的生长和分裂受到遗传和表观遗传的精密调控。异常的遗传变化(例如,基因突变,基因缺失,基因扩增或染色体易位)和/或表观遗传的异常(例如组蛋白修饰,基因的甲基化)都可能促进肿瘤的发生或者进展。含MARVEL穿膜域的趋化因子样因子超家族(CKLF-like MARVEL Transmembrane domain-containing Member,CMTM)原名趋化素样因子超家族(Chemokine Like Factor Superfamily,CKLFSF)是我国北京大学人类疾病研究中心发现并命名的新家族,后由于其成员编码产物中的MARVEL穿膜域的结构特征而被更名为CMTM家族,包含CLSF和CMTM1-8共9个成员。CMTM家族成员结构和功能特点是介于趋化因子和四跨膜蛋白超家族(Transmembrane 4 Super Family,TM4SF)之间。近年来对于该家族的研究不断完善,研究表明该家族编码产物与男性生殖系统、免疫系统、造血系统、心血管系统以及与肿瘤形成进展之间有密切联系。而CMTM家族与肿瘤的关系目前尚未统一结论,研究多认为CMTM家族为抑癌基因家族,家族成员在肿瘤中低表达并与肿瘤的恶性进展有关。但是,已有研究证明CMTM1在乳腺癌、肾细胞癌、肺癌及卵巢癌中高表达,并且CMTM1高表达组乳腺癌患者较低表达患者生存率低,说明其家族成员可能的促癌作用。CMTM4和CMTM8在多种实体瘤中低表达,然而CMTM2、CMTM3、CMTM6在胶质瘤中高表达。其中在转录组水平上,CMTM6 mRNA在胶质瘤中高表达,在蛋白质组水平上,通过免疫组化实验发现CMTM6蛋白在肝癌和头颈鳞癌中低表达。甚至同一个成员在同种肿瘤不同病理类型中作用也可能不一致,CMTM7高表达与肺腺癌病人预后呈正相关关系,而与肺鳞癌病人预后呈负相关关系。因此,CMTM家族成员在不同恶性肿瘤中的功能是不同的,因此进一步研究其在肿瘤发生、发展和转移中的作用和机制具有重要意义。研究为肿瘤检测和基因治疗找到新的分子靶点,为癌症患者带来新的希望。Bei等通过75对肝癌临床样本进行免疫组化染色,发现CMTM4蛋白在肝癌中低表达,是肝癌患者预后的独立危险因素,但缺乏对CMTM4在转录组水平的探索。针对CMTM家族成员与肿瘤的复杂关系,本研究通过网络公共数据库和临床样本从转录组和蛋白组,从细胞到组织验证CMTM4表达与肝癌的关系,并通过生物信息学技术探索其可能的作用机制,为加深对CMTM4分子的了解,推动CMTM4作为临床诊断治疗靶点的转化提供理论依据。目的本课题利用网络公共数据库和肝癌组织芯片数据,从转录组和蛋白组多层次探索CMTM4的表达以及其对于肝癌患者的诊断和预后价值。同时结合生物信息学技术手段探讨CMTM4在肝癌发生发展过程中的可能作用机制。方法1.下载癌症基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)和基因表达数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)中的人类肝癌基因mRNA表达谱文件,分析CMTM4 mRNA在肿瘤组织中的表达水平以及分析CMTM4 mRNA表达水平与肝癌患者临床病理特征和生存预后的关系。2.分别利用组织芯片与组织免疫组化染色结合的技术和免疫蛋白印迹技术验证肝癌组织及肝癌细胞系中CMTM4蛋白的表达水平;3.统计分析以及作图通过Graph Pad Prism 8.0和SPSS23.0软件实现。基因mRNA表达谱数据作为连续型变量,组间比较采用双侧Student’s t-test;无序分类资料组间比较采用卡方检验;有序分类资料组间比较采用Mann-Whitney’s检验;通过Kaplan-Meier生存曲线分析Log Rank检验探究基因表达与预后的关系;通过受试者工作曲线(Receiver Operating Characteristic,ROC)评价CMTM4对于肝癌组织的诊断价值。α<0.05被视为有统计学意义。4.通过R软件实现基因集合变异分析(Gene Set Variation Analysis,GSVA)包的安装、加载和运行,以Hall-Mark基因集作为背景基因集,分析CMTM4相关基因在肿瘤中富集的功能集和通路。结果1.肝癌组织中CMTM4mRNA的表达水平较癌旁组织中升高,差异有统计学意义。单因素分析提示CMTM4 mRNA的表达在不同TNM分期(P=0.007)、性别(P=0.019)的患者中有差异,而与年龄(P=0.384)、种族(P=0.065)、组织学分级(P=0.592)无明显相关。多因素分析结果提示CMTM4的表达水平(HR 1.434,P=0.013)及 TNM 分期(HR 1.904,P=0.000)是肝癌预后的独立危险因素。Kaplan-Meier分析结果提示CMTM4 mRNA高表达的肝癌患者的中位生存期(Overall Survival,OS)(P=0.005)和无进展生存期(Progression-free Survival,PFS)(P=0.015)较低表达患者预后差。2.CMTM4 mRNA对于肝癌组织有较好的鉴别诊断价值,ROC曲线下面积(Area Under Curves,AUC)如下:TCGA队列,AUC=0.704(P<0.001);GSE6764,AUC=0.816(P<0.001);GSE45436,AUC=0.921(P<0.001);GSE54238,AUC=0.710(P=0.007);GSE62232,AUC=0.854(P<0.001);GSE76297,AUC=0.887(P<0.001);GSE77314,AUC=0.758(P<0.001);AUC=0.745(P<0.001)。3.肝癌组织及肝癌细胞系中CMTM4蛋白较对照组减少(P=0.0008);4.CMTM4 mRNA高表达组主要富集于免疫通路并与免疫细胞的数量呈负相关关系;结论1.CMTM4 mRNA高表达的肝癌患者预后差,并与恶性临床病理特征有关,结合CMTM4 mRNA表达水平较好的诊断效能,提示CMTM4 mRNA可能作为肝癌患者诊断和预后潜在的生物标志物;2.CMTM4 mRNA高表达组主要富集于免疫通路并与免疫细胞的数量呈负相关关系,提示CMTM4可能与肝癌的免疫功能抑制有关,为接下来进一步研究提供方向。