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研究目的糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种高发病率和高死亡率的疾病,严重的困扰着人们的工作与生活。DM持续高血糖状态下,会诱导心脑血管产生一系列的并发症,其中尤以糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)的发病率最高。本课题通过检测1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)大鼠心肌Wnt/β-catenin及NF-κB这两条信号通路的变化,并分别以GSK-3β抑制剂(甲异靛)、NF-κB抑制剂(PDTC)灌胃给药,观察这两种抑制剂对T1DM大鼠心肌中Wnt/β-catenin及NF-κB这两条信号通路相关蛋白表达变化的影响,明确Wnt/β-catenin及NF-κB信号通路在DCM发生、发展中的作用,为DCM寻找新的靶点以及治疗方法提供理论依据。研究方法1.动物模型实验1.1.DM动物模型的建立将30只健康雄性SD大鼠,经过1周的适应性喂养,按照体重均衡的原则,随机分为两组,即对照组(control组)和模型组(DM组),其中control组10只,DM组20只。Control组、DM组禁食16 h后,DM组按60 mg/kg的剂量腹腔注射4℃现配的链脲佐菌素,同时Control组大鼠腹腔注射与DM组大鼠同体积的缓冲液。72 h后所有大鼠禁食12h,尾静脉采血检测空腹血糖值(FBG),T1DM大鼠模型成功标准:FBG≥16.7mmol/L,多饮、多食、多尿、且体重降低者。1.2.T1DM大鼠心肌Wnt/β-catenin及NF-κB信号通路相关蛋白的变化研究将造模成功的大鼠按血糖、体重均衡原则,随机分为4周以及8周DM模型组,每组10只。Control、DM两组大鼠均以普通饲料和蒸馏水继续饲养。分别于指定周期后,麻醉固定,腹主动脉取血,5-10mL每只,以3000 r/min的转速,离心10min,分离血清。取出心脏及主动脉,分离左心,HE染色观察各组别心肌组织病理变化,免疫组织化学法(immunohistochemical,IHC)检测各组大鼠心肌Wnt/β-catenin及NF-κB通路相关蛋白表达,western blotting(WB)方法检测各组大鼠心肌标本Wnt/β-catenin及NF-κB通路蛋白表达变化。2.动物给药实验2.1.DM动物模型的建立及分组将80只健康雄性SD大鼠,经过1周的适应性喂养,按照体重均衡的原则,随机分为两组,即对照组(Control组)和模型组(DM组),其中control组20只,DM组60只。Control组、DM组禁食16 h后,DM组按60 mg/kg的注射量腹腔注射4℃现配的链脲佐菌素,同时Control组大鼠腹腔注射与DM组大鼠同体积的缓冲液。72 h后所有大鼠禁食12 h,尾静脉采血检测FBG,T1DM大鼠模型成功标准:FBG≥16.7 mmol/L,多饮、多食、多尿、且体重降低者。2.2.甲异靛/PDTC干预1型DM大鼠心肌Wnt/β-catenin及NF-κB信号通路相关蛋白的变化研究将造模成功的大鼠按血糖、体重均衡原则,随机分为4、8周DM模型组、4、8周甲异靛(20mg/kg/d)给药组及4、8周PDTC给药(100 mg/kg/d)组,每组10只。Control、DM模型、DM给药组大鼠均以普通饲料和蒸馏水继续饲养。分别于指定周期后,麻醉固定,腹主动脉采血,5-10mL每只,以3000r/min的转速,离心10min,分离血清。取出心脏及主动脉,分离左心,HE染色观察各组别心肌组织病理变化,IHC法检测各组大鼠心肌Wnt/β-catenin及NF-κB通路蛋白表达,wstern blotting(WB)以及qRT-PCR方法检测各组大鼠心肌标本Wnt/β-catenin及NF-κB通路相关蛋白及基因表达变化。结果1.DM大鼠一般状况实验期间,control对照组大鼠皮毛柔顺有光泽、状态良好、健壮,对外界反应灵敏,自主活动正常,无死亡。与control组大鼠相比,DM模型组大鼠出现逐渐消瘦,精神萎靡,皮毛杂乱、黯淡无光泽,腥臊臭味加重等现象;且随着时间的延长,多饮、多食、多尿和消瘦等DM的标志性症状加重,生存状态越来越差;且8周DM组大鼠CI及LVMI比control组明显升高。与DM组比较,4周给药组大鼠体重稍有增加,精神较DM模型组略好;随着给药时间的延长,至8周时,给药组大鼠体重较DM组增加明显,血糖明显降低,LVWI显著降低,生存状态明显好转。2.T1DM大鼠心肌相关信号通路的蛋白表达研究HE染色结果表明,control组大鼠心肌细胞形态正常,细胞分布均匀,无变形、坏死等变化;DM模型组大鼠心肌细胞明显增大,胞质丰富,排列紊乱,且大小不规则,尤其是8周DM模型组的大鼠,局部心肌细胞凝固性坏死,胞质嗜酸性增强,核固缩深染,纤维组织增生,坏死灶内淋巴细胞大量增生。IHC结果显示,DM模型组中GSK-3β蛋白的阳性表达比control组减少,且出现部分核表达,而p-GSK-3β的阳性表达区域要比control组增多;与control对照组比较,β-catenin、NF-κB p65、IκBα蛋白在DM模型组中的阳性表达增加,均有少量核表达。WB结果表明,与control对照组大鼠比较,4周DM组大鼠心肌TNF-α的表达明显升高(P<0.05),DM大鼠心肌NF-κB p65、IκBα、p-GSK-3β表达明显增加(P<0.05),p-IκBα表达明显减少(P<0.05),Wnt2、β-catenin表达明显升高(P<0.05)。与4周DM大鼠比较,8周DM大鼠心肌IκBα、Wnt2、β-catenin表达显著升高(P<0.05),p-IκBα蛋白的表达持续减少(P<0.05),p-GSK-3β的表达无明显变化。3.甲异靛/PDTC干预T1DM大鼠心肌相关信号通路蛋白表达的研究HE染色结果表明,与DM模型组大鼠心肌细胞比较,甲异靛/PDTC给药组心肌组织中偶见心肌细胞点灶状炎症浸润坏死灶,心肌肥大、心肌纤维化等病变有不同程度的缓解。IHC结果显示,与DM模型组比较,给药组p-GSK-3β蛋白在心肌中的阳性表达减少;给药组β-catenin、NF-κB p65蛋白比DM模型组中的阳性表达也明显减少(P<0.05),细胞核、细胞质表达均匀;与DM模型组比较,p-NF-κB p65、IκBα蛋白在给药组中的阳性表达有所增加。WB结果表明,与DM大鼠比较,给药组大鼠心肌TNF-α、IL-2的表达明显减少(P<0.05),NF-κB p65、p-GSK-3β、Wnt2、β-catenin表达明显减少(P<0.05),p-NF-κB p65、IκBα表达明显增加(P<0.05)。qRT-PCR结果显示,与control对照组比较,DM模型组大鼠心肌β-catenin、NF-κB p65、IκBαmRNA的表达量明显升高(P<0.05);与DM模型组比较,给药组β-catenin、NF-κB p65 mRNA的表达量明显减少(P<0.05),IκBαmRNA的表达量明显升高(P<0.05),GSK-3β表达明显减少(P<0.05),结果与WB显示一致。结论1.DM大鼠造模成功后,在DM的发生发展过程中,CI及LVWI明显增高,左心出现肥厚,伴随有心肌炎症及心肌纤维化,心功能逐渐减弱。2.在T1DM大鼠心肌中,Wnt/β-catenin及NF-κB这两条信号通路均处于激活状态,随着时间的增加,心肌炎症、心肌纤维化加重。表明Wnt/β-catenin及NF-κB信号通路在DCM发生发展中起着重要作用。3.对T1DM大鼠进行甲异靛或PDTC灌胃给药治疗后,可以通过抑制Wnt/β-catenin及NF-κB信号通路,从而对DM大鼠的心肌损伤起到修复作用。