胆汁淤积是婴儿期肝病最常见的临床表现,其病因多种多样。肝细胞功能缺陷或胆管阻塞、胆汁流减少均可导致婴儿胆汁淤积症的发生。如治疗不及时,可导致胆汁淤积性肝纤维化甚至肝硬化,是婴儿期致死或致残的重要原因之一。已成为我国小儿肝病住院的首要原因。早期明确诊断,治疗及时是遏制其进展的关键。由于婴儿生长发育的特殊性,寻找疗效可靠、副作用小、适合小儿应用的药物是我们亟待解决的问题。目前发现,熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic Acid,UDCA)可以通过利胆、保护肝细胞、改善肝细胞的排泄功能来抑制肝纤维化的病理过程。本课题建立了α-萘异硫氰酸酯(α-Naphthylisothiocyanate,ANIT)诱导的幼鼠胆汁淤积症模型,并以UCDA治疗,旨从动物实验方面模拟UCDA治疗婴儿胆汁淤积症,通过检测新生大鼠肝功能各项生化指标、血清肝纤四项、肝组织Ⅳ型胶原(CollagenⅣ,cIV)、层粘连蛋白(Laminin,LN)及病理形态学变化,以探讨UDCA对胆汁淤积性症幼鼠的治疗作用。以期找到有效的早期干预婴儿胆汁淤积症的治疗方法。第一部分:熊去氧胆酸对胆汁淤积症幼鼠肝功能指标的影响目的:拟通过制造幼鼠胆汁淤积症模型以探讨UDCA对胆汁淤积症幼鼠肝功能指标的作用及影响。方法:健康的3周龄Spragne-Dawlay(SD)大鼠,饲养于河北医科大学第三医院动物实验中心,清洁级,体质量50-70g,雌雄各半,(合格证编号:1307128,1308020,1308039)。置于室温25℃左右、喂养标准饲料,饮水自由[1]。随机分为3组,分别为造模组(ANIT Model)18只、熊去氧胆酸治疗组(UDCA Treatment)17只、空白对照组(Blank Control)8只。采用ANIT灌胃诱发幼鼠胆汁淤积症模型。ANIT Model组于实验第4天给予1%ANIT 75mg/kg灌胃;UDCA Treatment组:于实验第2天开始每天给予UDCA溶液灌胃(100mg/kg),同时于实验第4天也给予ANIT灌胃;Blank Control组:空白对照,同步喂养。于ANIT灌胃48小时后断头采血,动物灌胃前后12 h均禁食,不禁水。检测经UDCA治疗后对大鼠肝功能各项生化指标的影响。分别对丙氨酸氨基转移酶(Alanine Aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate Amino transferase,AST)、γ-谷酰转肽酶(γ-Glutamyl Transpeptidase,γ-GT)、胆碱酯酶(Cholines terase,CHE)、胆汁酸(Total Bile Acids,TBA)采用生化检验速率方法检测,分别对总胆红素(Total Bilirubin,TBIL)、直接胆红素(Direct Bilirubin,DBIL)、间接胆红素(Indirect Bilirubin,IBIL)采用生化检验比色方法进行检测[1]。结果:肝功能各项指标(ALT、AST、TBIL、DBIL、IBIL、γ-GT、CHE、TBA)于Blank Control组统计结果分别为:47.1±15.8(U/L),386.4±138.8(U/L),3.0±0.9(umol/L),2.5±1.1(umol/L),0.5±0.3(umol/L),0.4±3.4(U/L),0.26±0.04(KU/L),194.3±130.9(umol/L);ANIT Model组肝功能各项指标(ALT、AST、TBIL、DBIL、IBIL、γ-GT、CHE、TBA)统计结果分别为:782.6±251.2(U/L),2265±524.8(U/L),142.3±25.3(umol/L),129.1±23.0(umol/L),12.8±5.3(umol/L),15.7±6.1(U/L),0.25±0.05(KU/L),657.5±95.1(umol/L);UDCA Treatment组肝功能各项指标(ALT、AST、TBIL、DBIL、IBIL、γ-GT、CHE、TBA)统计结果分别为:618.1±195.7(U/L),1990.7±850.6(U/L),138.9±14.4(umol/L),127.1±11.1(umol/L),11.9±4.7(umol/L),11.1±3.3(U/L),0.25±0.04(KU/L),608.2±63.0(umol/L)。ANIT Model组与Blank Control组肝功能各项比较,P值分别为:P=0.000<0.01,P=0.002<0.01,P=0.000<0.01,P=0.000<0.01,P=0.000<0.01,P=0.000<0.01,P=0.075>0.05,P=0.001<0.01;UDCATreatment组与ANIT Model组肝功能各项比较,P值分别为:P=0.440>0.05,P=0.079>0.05,P=0.091>0.05,P=0.057>0.05,P=0.101>0.05,P=0.047<0.05,P=0.724>0.05,P=0.002<0.05。ANIT Model组除CHE外,各项指标结果均明显高于Blank Control组,有显著性差异。γ-GT、TBA在UDCA Treatment组明显较ANIT Model组降低,有统计学差异。余数值均无显著性差异。结论:1经1%ANIT 75mg/kg灌胃48小时后,ANIT Model组肝功能各项指标除CHE外,余ALT、AST、γ-GT、TBA、TBIL、DBIL、IBIL均明显高于Blank Control组(P<0.01),表明造模成功。2动2动物实验显示:γ-GT、TBA在UDCA Treatment组中数值,明显较ANIT Model组降低,有统计学差异(P<0.05);表明UDCA有可能通过降低血清γ-GT、TBA改善肝功能。3 UDCA Treatment组ALT、AST、TBIL、DBIL、IBIL、CHE相比ANIT Model组,无统计学差异;考虑与本实验样本量较小,UDCA作用时间较短有关,以后可通过加大样本量,增加药物作用时间等来进一步证实其作用。第二部分:熊去氧胆酸对胆汁淤积症幼鼠血清肝纤四项指标的影响目的:拟通过制造幼鼠胆汁淤积症模型以探讨UDCA对胆汁淤积症幼鼠血清肝纤四项指标的作用及影响。方法:造模方法同第一部分。检测经UDCA治疗后,大鼠血清透明质酸(Hyaluronic Acid,HA)、Ⅲ型前胶原(Procollagen III,PCⅢ)、LN、cIV的变化。采用上海海研医学生物公司生产的肝纤四项放射免疫测定试剂盒检测HA、PCⅢ、LN、cIV肝纤四项指标。结果:Blank Control组肝纤四项(HA、PCⅢ、LN、cIV)统计结果分别为:1489.75±215.30(ng/ml),40.37±1.55(ng/ml),39.65±5.40(ng/ml),24.92±4.08(ng/ml);ANIT Model组肝纤四项(HA、PCⅢ、LN、cIV)统计结果分别为:1772.68±316.90(ng/ml),41.20±11.04(ng/ml),48.47±8.75(ng/ml),30.79±7.43(ng/ml);UDCA Treatment组肝纤四项(HA、PCⅢ、LN、cIV)统计结果分别为:1608.50±409.94(ng/ml),41.63±4.63(ng/ml),41.71±5.58(ng/ml),23.95±7.85(ng/ml)。ANIT Model组与Blank Control组肝纤四项比较:P值分别为:P=0.106>0.05,P=0.107>0.05,P=0.002<0.05,P=0.045<0.05;UDCA Treatment组与ANIT Model组肝纤四项比较,P值分别为:P=0.119>0.05,P=0.117>0.05,P=0.002<0.01,P=0.000<0.01;ANIT Model组血清中LN、cIV明显高于Blank Control组(P<0.05),有统计学差异。而HA、PCⅢ与Blank Control组相比无统计学差异;UDCA Treatment组LN、cIV明显低于ANIT Model组(P<0.01),有显著性差异。而HA、PCⅢ与ANIT Model组相比均无统计学差异。结论:1 ANIT Model组血清中LN、cIV明显高于Blank Control组,表明造模成功。2 UDCA可通过降低血清中LN、cIV而起到抗肝纤维化的作用。第三部分:熊去氧胆酸对胆汁淤积症幼鼠肝组织病理学的影响目的:拟通过制造幼鼠胆汁淤积症模型以探讨UDCA对胆汁淤积症幼鼠肝组织cⅣ及LN及病理学的作用及影响。方法:造模方法同第一部分。随机分为3组,分别为造模组(ANIT Model)13只、熊去氧胆酸治疗组(UDCA Treatment)13只、空白对照组(Blank Control)10只。采血后,3组大鼠分别打开腹腔,于肝脏切取组织1.0×0.3×0.8cm,在10%福尔马林中进行固定,之后脱水及包埋,切片后进行cⅣ及LN免疫组化染色,观察组织学变化,免疫组化结果应用Image Pro Plus 6.0专业图像分析软件分析后,各指标分别进行统计学分析。结果:1 Blank Control组LN、cIV统计结果分别为:0.0405±0.0125,0.0167±0.0027;ANIT Model组LN、cIV统计结果分别为:0.0576±0.0077,0.0215±0.00030;UDCA Treatment组LN、cIV统计结果分别为:0.0382±0.0081,0.0181±0.0028。ANIT Model组与Blank Control组LN、cIV比较,P值分别为:P=0.002<0.01,P=0.000<0.01;UDCA Treatment组与ANIT Model组LN、cIV比较,P值分别为:P=0.001<0.01,P=0.000<0.01;均有显著性差异。ANIT Model组肝组织中LN、cIV明显高于Blank Control组(P<0.01);UDCA Treatment组肝组织中LN、cIV均明显低于ANIT Model组(P<0.01),均有统计学意义。2肝组织病理学改变:常规HE染色制片后镜检观察肝细胞变性、胶原纤维增生程度和组织形态学变化。Blank Control组肝细胞整齐排列,肝小叶清晰完整,条索样放射到四周,未见炎性细胞浸润,中央静脉、汇管区未见结缔组织异常增生;ANIT Model组,肝小叶结构大多破坏或消失,出现了较明显的肝纤维化,肝组织1/4-3/4均出现脂肪坏死,甚至气球样变,仅少量正常肝细胞存留,可见淤胆,坏死区域可见结缔组织增生明显,形成纤维间隔,将原有的肝小叶分割,形成假小叶。伴随大量嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞浸润[1]。3 cIV、LN行免疫组化染色:Blank Control组的肝组织中,可见微量的cIV、LN在肝窦壁及血管壁沉积,呈连续性线状阳性反应;在ANIT Model组以及UDCA Treatment组中,LN的棕黄色颗粒较cⅣ而言粗大且色深。棕黄色颗粒沉积区域以肝窦、门脉区和肝细胞坏死区最为明显,其间可见细胞碎屑样坏死。ANIT Model组较强阳性反应,出现较粗线性纤维,并形成网隔伸入小叶,分隔肝细胞。在炎症坏死区域,阳性反应部分相互交织成网状,其内浸入有数量不等的炎性细胞。无论是cⅣ还是LN,UDCA Treatment组相较ANIT Model组而言棕黄色颗粒沉积的阳性区域面积均缩小明显,可见其内碎屑样坏死,较弱线状阳性反应网状交织于肝实质及汇管区。结论:1 ANIT Model组肝组织中LN、cIV明显高于Blank Control组;ANIT Model组幼鼠肝组织正常的肝小叶结构已被破坏或消失,汇管区胆管结构破坏并伴随大量嗜中性粒细胞及嗜酸性粒细胞浸润,表明造模成功。2 UDCA通过降低肝组织中LN、cIV而起到抗肝纤维化、防止肝硬化形成的作用。