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近年来集约化养殖模式不断推广,水产养殖业得以迅速发展,同时也面临着许多因养殖密度过高、饲料投喂频繁、药物滥用等带来的环境问题,养殖水产动物也面临多种环境因子的胁迫。而作为水环境中一项重要的影响因子,pH突变会对虾体的酸碱平衡和渗透调节等功能造成胁迫,降低虾体的免疫能力,继而抑制其生长。为研究钠氢交换体（Na+/H+-exchanger,NHE）和碳酸酐酶（Carbonic Anhydrase,CA）在中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）响应pH胁迫过程中发挥的作用,首先采用静水毒性实验方法确定了中国对虾72 h酸碱半致死pH,然后利用RACE技术克隆了中国对虾钠氢交换体（Na+/H+-exchanger isoform 3）、细胞质碳酸酐酶（cytoplasmic Carbonic Anydrase）和糖基磷脂酰肌醇碳酸酐酶（glycosyl-phosphatidylinositol-linked Carbonic Anhydrase）,并通过荧光定量PCR及RNA干扰技术分析了其在pH胁迫下的表达特征及功能,通过原位杂交观察胁迫前后三种基因在对虾鳃组织中的分布差异,以期了解NHE3和CA在中国对虾适应pH胁迫中的作用机制,并为研究甲壳动物酸碱水环境适应机制提供理论依据。1.实验对中国对虾在不同pH梯度胁迫下的死亡率进行了统计分析,发现pH为4.6和9.7时,72 h累计死亡率达到100%,pH为6.6和8.1时近乎没有出现死亡个体,通过寇氏法分别计算出中国对虾酸性半致死pH值及碱性半致死pH分别为5.2和9.1;取不同pH胁迫下的对虾鳃组织,做HE染色处理,结果显示碱性半致死pH（pH 9.1）胁迫下对虾鳃组织损伤较对照组和酸性半致死pH（pH 5.2）胁迫组严重,出现明显的鳃丝肿大,血细胞肿胀等现象。2.克隆获得中国对虾钠氢离子交换体（Na+/H+-exchanger isoform 3）基因,命名为FcNHE3,该基因cDNA序列全长3508 bp,开放阅读框2805 bp,编码934个氨基酸,具有信号肽和12个跨膜结构域;蛋白同源分析发现,FcNHE3与青蟹（Carcinus maenas）同源性最高,达到74%;系统进化分析显示,FcNHE3与三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）和青蟹（Carcinus maenas）亲缘关系最近。荧光定量PCR分析表明,FcNHE3基因在鳃组织中表达量显著高于其他组织（P<0.05）;酸性半致死pH（pH 5.2）胁迫下,FcNHE3基因在整个胁迫过程中显著上调表达（P<0.05）;碱性半致死pH（pH 9.1）胁迫下,FcNHE3基因在前48 h显著下调表达（P<0.05）,12 h表达量最低,仅在72 h出现上调表达。原位杂交结果显示,酸性半致死pH（pH 5.2）胁迫组杂交信号较碱性半致死pH胁迫（pH 9.1）组和对照组都强,说明了在酸性半致死pH胁迫下FcNHE3基因表达较高,与pH胁迫24 h后qPCR实验结果一致。RNA干扰结果显示,注射siRNA后,FcNHE3基因表达受到抑制,pH 5.2胁迫下对虾存活率相比对照组显著下降。当FcNHE3基因被干扰3h后si-3组干扰效率最高,该时间点FcCAc、FcCAg、V-H+-ATPase（VHA）和Na+/HCO3-cotransporter（NBC）与对照组相比表达均下调,HCO3-cotransporter（AE）、Na+/K+/Cl-cotransporter（NKCC）基因表达相对上调。研究表明FcNHE3在中国对虾响应pH胁迫过程中尤其在酸性水环境中可能发挥重要的调节作用。3.克隆获得中国对虾两种碳酸酐酶基因,分别为细胞质碳酸酐酶（cytoplasmic Carbonic Anydrase）,命名为FcCAc和中国对虾糖基磷脂酰肌醇碳酸酐酶（glycosyl-phosphatidylinositol-linked Carbonic Anhydrase）,命名为FcCAg,系统进化分析显示,两种基因均与凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）亲缘关系最近。组织表达分布结果显示,两种基因表达量均在鳃组织中最高;在酸性半致死pH（pH5.2）胁迫下,FcCAc基因表达呈波浪式变化,先升高后降低,72 h基本恢复至对照组水平（P<0.05）;在碱性半致死pH（pH 9.1）胁迫下,0-24 h一直处于下调表达,且24 h处表达量最低,而后表达量回升,72 h上调表达（P<0.05）;对于FcCAg基因,在酸性半致死pH（pH 5.2）胁迫下,基因在整个过程中大致处于显著上调表达,在12 h处表达量最高（P<0.05）;在在碱性半致死pH（pH 9.1）胁迫下,前24 h基因一直处于显著下调表达,而24 h后表达水平回升,到72 h达到上调表达。对酸碱胁迫24h的样品进行原位杂交检测,结果显示相较于对照组,FcCAc在酸性半致死pH（pH 5.2）和碱性半致死pH胁迫（pH 9.1）组杂交信号均较弱,说明了在pH胁迫下24 h FcCAc基因表达有所降低;FcCAg在酸性半致死pH胁迫组杂交信号较碱性半致死pH胁迫组和对照组都强,而碱性半致死pH胁迫组杂交信号最弱,说明了在低pH胁迫下FcCAg基因表达较高;与胁迫实验中24 h基因表达量情况相符合。RNA干扰后,FcCAc和FcCAg均受到抑制,pH 5.2胁迫下对虾存活率相比对照组显著下降。当FcCAc被干扰3 h后si-3组干扰效率最高,该时间点离子转运相关基因FcNHE3、FcCAg、FcVHA和FcAE基因表达相对下调,而FcNBC和FcNKCC基因表达相对上调;当FcCAg基因被干扰3 h后si-1组干扰效率最高,该时间点,所选取离子转运相关基因均表达下调。说明该两种基因可能通过与其他离子转运相关基因相互作用共同在中国对虾响应pH胁迫中发挥重要功能。