论文部分内容阅读
安丝菌素(Ansamitocin)是微生物来源的美登素类(Maytansinoid)抗生素,具有很强的真核细胞毒性和抗肿瘤活性,其中安丝菌素P-3(AP-3)活性最显著。作为理想的靶向化药物的毒性物,安丝菌素在新型抗肿瘤药物抗体偶联物研究中备受关注。2013年罗氏抗体药物偶联物Kadcyla被FDA批准用于治疗HER-2阳性晚期转移性乳腺癌。此外,还有SAR3419、BT062、BAY94-9343等多个美登素类偶联物也都处于Ⅰ～Ⅱ期临床试验阶段,取得了显著的临床效果。目前,安丝菌素发酵水平低下,且市场价格昂贵,严重限制了对其进一步药理研究及应用。因此对珍贵橙色束丝放线菌发酵过程进行优化与调控以提高AP-3发酵水平具有积极的现实意义。本文以珍贵橙色束丝放线菌APSP-01为研究菌株,对其发酵生产AP-3的培养基和培养条件进行了优化,并对其进行放大研究,建立了发酵动力学模型,确定了最佳流加培养策略,得出以下结论：采用单因素试验与均匀设计相结合的方法对AP-3发酵培养基进行了优化。首先采用单因素试验法考察了培养基中碳源、有机氮源和铵盐等成分对AP-3产量的影响,然后采用均匀实验设计U*15(157)对其进一步进行优化,确定最佳发酵培养基组成为：葡萄糖4.22%,麦芽糖0.75%,玉米浆3.42%,乙酸铵0.41%,异丁醇0.43%。在最优培养基下进行验证试验,得到AP-3产量为(51.86±1.33)mg/L,与模型预测值相符,为后续实验提供了依据。对珍贵橙色束丝放线菌产AP-3的摇瓶发酵条件进行了优化。将单因素试验和Box-Behnken试验设计结合,并应用SAS8.1软件对试验数据进行响应面分析,得到二次回归拟合方程,模型P<0.01,回归模型极显著,相关系数R2=0.9696,模型拟合程度较好。解方程确定最佳发酵条件为接种量13%、转速220r/min、初始pH为7.4、发酵时间8d,经试验验证,试验值与预测值非常接近,AP-3产量最大值达到82mg/L,较单因素试验提高了10.6%。利用5L发酵罐对APSP-01产AP-3的发酵工艺进行了放大,对其分批发酵动力学进行了研究。首先对发酵过程代谢特征进行了分析,确定AP-3合成属于非生长偶联模型。依据Logistic方程和Leudeking-piret方程,采用遗传算法对菌体生物量、AP-3合成、残糖含量按照模型进行参数估计,以此作为初始值,进一步对其进行非线性回归拟合,得出了该菌株分批发酵生产AP-3的菌体生长、AP-3合成以及基质消耗动力学模型及参数。所建模型基本能够描述AP-3分批发酵动态过程,为以后的补料分批培养试验提供参考。对AP-3的分批流加培养进行了研究。研究了补料时间、补料方式等条件对菌株发酵AP-3的影响,最终确定补料策略为：在发酵约84h,残糖浓度降至20g/L以下,采用恒速补料的方式补入流加培养基,在此工艺条件下,发酵216h,最终AP-3产量达92.24mg/L,比优化前提高了28.11%。