【摘 要】
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3-羟基丙酸（3-Hydroxypropionic acid,3-HP）和1,3-丙二醇（1,3-Propanediol,1,3-PD）是两种重要的高附加值平台化合物,广泛应用于食品、医药、化工等领域。生物法合成3-HP和1,3-PD因成本低廉、环境友好、副产物少等优势备受瞩目。目前,利用罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）转化甘油联产3-HP和1,3-PD已有大量报道,但都
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3-羟基丙酸（3-Hydroxypropionic acid,3-HP）和1,3-丙二醇（1,3-Propanediol,1,3-PD）是两种重要的高附加值平台化合物,广泛应用于食品、医药、化工等领域。生物法合成3-HP和1,3-PD因成本低廉、环境友好、副产物少等优势备受瞩目。目前,利用罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）转化甘油联产3-HP和1,3-PD已有大量报道,但都面临着终产物浓度低和中间代谢物3-羟基丙醛（3-HPA）积累问题。因此,筛选3-HP和1,3-PD高产菌株,探索开发新型全细胞催化体系和转化技术高效生物合成3-HP和1,3-PD,有望为工业化生产提供一种可行的替代方案。有鉴于此,本研究开展了以下工作:（1）以婴儿粪便为样品,通过富集培养、比色法初筛及高效液相色谱法（HPLC）复筛,结合分子生物学鉴定,最终从粪便样品中筛选获得一株高产3-HP和1,3-PD的罗伊氏乳杆菌,命名为L.reuteri FXZ014。（2）采用单因素法优化高产菌株L.reuteri FXZ014的全细胞培养条件,得到最佳培养条件为:在40 m M甘油诱导下,厌氧培养12 h;接着对L.reuteri FXZ014的全细胞转化条件进行响应面法优化,最佳条件为:菌体量13 g/L CDW,甘油浓度330 m M和转化时间3.0 h。在最佳条件下进行全细胞生物合成,得到3-HP和1,3-PD总产量为18.68 g/L,生产强度为6.23 g/L/h。（3）克隆编码琥珀酸半醛脱氢酶基因gab D4,成功构建表达Gab D4的基因工程大肠杆菌（Escherichia coli）,命名为E.coli Gab D4。克隆编码1,3-丙二醇氧化还原酶基因pdu Q,成功构建表达Pdu Q的基因工程菌E.coli Pdu Q。构建共表达载体,实现Gab D4和Pdu Q在同一基因工程菌E.coli Gab D4-Pdu Q中的共表达。利用上述成功构建的基因工程菌E.coli Gab D4、E.coli Pdu Q和E.coli Gab D4-Pdu Q,与前期实验筛选获得的L.reuteri FXZ014混合,基于不同菌株和全细胞配比,开发设计了6个多菌混合转化体系,其中双菌混合转化体系CS-2生产性能最佳,其由50%的L.reuteri FXZ014和50%的E.coli Gab D4-Pdu Q组成。选取全细胞生物转化过程关键因素,进一步对最优转化体系CS-进行优化,最佳条件为:菌体量20 g/L,甘油浓度60 g/L,转化时间4 h。在最优条件下进行生物转化,体系CS-2产生3-HP和1,3-PD总产量为45.15 g/L,生产强度达到11.28 g/L/h,两项指标与单一L.reuteri FXZ014转化相比,分别提高了141.7%和81%。（4）通过UTR工程技术,调控E.coli Gab D4-Pdu Q中Gab D4和Pdu Q表达量,构建了5株UTR工程菌,分别替代体系CS-2中的E.coli Gab D4-Pdu Q,形成5个新双菌混合体系。其中,体系CS-2-V3积累的3-HPA最少,表明该体系代谢途径平衡较佳,3-HP和1,3-PD总产量达到85.63 g/L,比体系CS-2提高了89%。基于体系CS-2-V3,设计了三种不同的全细胞生物转化策略,研究结果表明,使用两步法转化策略,体系CS-2-V3的3-HP和1,3-PD产量进一步提高,达到119.3 g/L;使用连续流加低浓度甘油的补料转化技术进行3-HP和1,3-PD生产,两种代谢物产量进一步提高,高达159.92 g/L;进一步,同时流加低浓度甘油和新鲜静息细胞,在此转化技术下,3-HP和1,3-PD产量大幅度提高,3-HP和1,3-PD产量分别为125.93和88.46 g/L;总产量高达214.39 g/L,生产强度为8.93g/L/h。与单一L.reuteri FXZ014转化相比,3-HP和1,3-PD产量分别提高了13.4和7.9倍;总产量提高了10.4倍,生产强度提高了43.3%。
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